Всё живое на Земле подчиняется суточному ритму сна и бодрствования. Исключения не составляют даже растения. Листки подорожника днём принимают горизонтальное положение, а ночью складываются наподобие зонтика. При полном солнечном освещении цветки одуванчика становятся жёлтыми и пушистыми, в темноте же плотно смыкают лепестки. Долгое время считалось, что суточный ритм жизнедеятельности зависит только от внешних факторов, а именно от освещённости.
В 1729 году французский астроном Жан-Жак де Меран заинтересовался гелиотропами (от греч. helios — солнце, tropos — поворот) — растениями семейства бурачниковых, которые поворачивают соцветия вслед за солнцем и опускают свои листья на ночь. К своему удивлению, де Меран обнаружил, что гелиотропы продолжают поднимать и опускать листья в полной темноте. Но дальше наблюдения учёный не пошёл, не сделав никаких выводов из своего опыта.
Эксперименты де Мepaнa продолжил тридцать лет спустя его соотечественник ботаник Анри-Луи Дюамель. Он поместил горшок с гелиотропом в тёмный погреб. Вечером и утром учёный навещал своего питомца и заставал цветок либо «спящим», либо «бодрствующим» с развёрнутыми листочками. Более того, учёный поставил цветок в тёмный сундук и для поддержания постоянной температуры плотно накрыл его одеялами. Но ничто не помогло — цветок продолжал соблюдать режим сна и бодрствования. Дюамель пришёл к смелому заключению: «…движение листьев растений не зависит от света и тепла». Тогда от чего же?
Через сто лет за дело взялся великий швейцарский ботаник Огюстен Пирам Декандоль. Днём и ночью шесть ярких фонарей освещали мимозу, но та продолжала складывать листья на ночь и расправлять их с утра. Когда же Декандоль стал освещать листья только по ночам, мимоза перешла на новый ритм — днём спала, а ночью бодрствовала. Потом, правда, она вернулась к прежним привычкам.
Вывод однозначный: суточный ритм растений есть некое внутреннее свойство, присущее им вне зависимости от светового дня. Но прошло ещё долгое столетие, пока не было доказано, что «внутренний хронометр» имеется и у животных, в том числе у человека.
В 1938 году знаменитый американский нейрофизиолог Натаниэль Клейтман и студент Чикагского университета Брюс Ричардсон провели 32 дня в Мамонтовой пещере (штат Кентукки). Пытаясь переключиться на 28-часовой суточный цикл, они хотели доказать, что суточный ритм человека — не присущее организму свойство, а реакция на окружающий мир. Но к однозначному выводу смелые экспериментаторы прийти не смогли: молодой организм студента перестроился на новый цикл, а вот сорокалетнему Клейтману это не удалось. Кроме того, исследователи не учли, что любой световой сигнал, а не только солнечный свет, может служить, говоря научным языком, цайтгебером (нем. Zeitgeber — устройство, задающее время).
В 1962 году немецкий физиолог Юрген Ашофф провёл исследования на своих сыновьях в подземном свето- и звуконепроницаемом бункере. Испытуемым разрешалось включать и выключать свет согласно их внутреннему ритму. Ашофф записывал циклы сна-бодрствования, температуру тела, объём мочи и другие физиологические и поведенческие показатели. Опыты Ашоффа доказали: существует «встроенный хронометр», позволяющий нам просыпаться без будильника, падающих на лицо лучей солнца или бодрящего аромата сваренного кофе.
Из эксперимента Ашоффа был сделан ещё один очень важный вывод: внутреннее время человека идёт медленнее реального — оно запаздывает примерно на час. Такой врождённый ритм называется циркадным (лат. сirca dies — около суток). Внутренние циркадные ритмы растений составляют 23—28 часов, а животных — 23—25 часов. Под воздействием светового дня циркадные ритмы превращаются в 24-часовые суточные циклы. Циркадные ритмы обнаружены у всех представителей животного царства и на всех уровнях организации.
В 1972 году американским исследователям Роберту Муру и Виктору Эйхлеру удалось показать, что циркадным ритмом млекопитающих управляет супрахиазматическое ядро (СХЯ), расположенное в головном мозге в основании гипоталамуса (см. «Наука и жизнь» № 1, 2005 г.). СХЯ человека представляет собой совокупность около 20 тысяч нейронов и настраивается с помощью внешних сигналов, в основном дневного света. СХЯ обрабатывает информацию о длине светового дня и посылает сигнал в орган промежуточного мозга — эпифиз, где секретируется гормон сна — мелатонин. Но гипоталамус реагирует на внешние сигналы, а откуда же берётся внутренний суточный ритм?
Первые доказательства генетической природы циркадных ритмов были найдены в 1971 году в экспериментах с плодовой мушкой Drozophila malanogaster, которые проводили Рон Конопка и Сеймур Бензер из Калифорнийского технологического института. Нормальная плодовая мушка имеет 24-часовой ритм суточной активности. Конопка обнаружил, что у одних мушек этот ритм смещён в сторону уменьшения (до 19 часов), а у других — в сторону увеличения (до 29 часов). Также в популяции были совсем «неправильные» — аритмичные дрозофилы, у которых периоды сна и бодрствования чередовались случайным образом. С помощью техники картирования генов (gene mapping) все три различные мутации были обнаружены на одном и том же участке Х-хромосомы, который затем получил название Period или Per. То есть все отклонения мушек от правильного циркадного поведения обусловлены различными дефектами гена Per! Это был первый в мире часовой ген, который стал известен учёным. После его клонирования удалось синтезировать белковую молекулу, за производство которой отвечает ген Per. Белок назвали PER (прописными буквами, чтобы отличить от соответствующего ему гена).
Дальнейшие исследования показали, что Per активен в основном в зрительных клетках дрозофилы, что неудивительно. Оказалось, что белок PER проявляет цикличность: его максимальная концентрация регистрируется в клеточном ядре (то есть там, где проходит синтез белка) поздней ночью. Соответствующая ему мРНК — молекула, передающая информацию от гена Per рибосоме, на которой происходит синтез белка PER, тоже пульсирует в суточном ритме, но пик её концентрации приходится на 6 часов раньше, чем у белковой молекулы PER. Это и понятно — сначала активируется ген, затем синтезируется мРНК, а спустя некоторое время в ядрах клетки начинает нарабатываться белок.
Через несколько лет после эпохального открытия Конопки у плодовой мушки был обнаружен ещё один часовой ген, названный Timeless (безвременный), сокращённо — Tim. Причём для сохранения нормальной суточной активности мушкам необходимы и Tim и Per одновременно. Ещё один часовой ген — Frequency (частота), или Frq, был обнаружен у нейроспоры — разновидности мицелиальных грибов, иногда называемых «красной хлебной плесенью». Пришёл черёд открытий генетических «часов» у млекопитающих.
В начале 1990-х годов группа исследователей из Национального центра биологического времени (Северо-Западный университет, штат Иллинойс, США) под руководством Джозефа Такахаши впервые идентифицировала мышиный часовой ген Сlock. Но означает это слово вовсе не «часы», как можно было бы подумать, оно представляет собой аббревиатуру от circa-dian locomotor output cycles kaput, что можно с натяжкой перевести как «циркадный прерыватель циклов двигательной активности». В то время ещё не была отработана техника нокаута (см. «Наука и жизнь» № 12, 2007 г.) — получения животных с «выбитым» геном. Поэтому маленькая, на пять страничек, статья в журнале «Science» за 1994 год на деле представляла собой квинтэссенцию труда огромной лаборатории в течение нескольких лет!
Вот краткая суть этой работы, которую стоит изложить, хотя бы для того, чтобы понять цену полученного вывода: «…был обнаружен ген, мутации в котором удлиняют суточный цикл и отменяют его периодичность». В своих опытах американские исследователи использовали N-этил-N-нитрозилмочевину (ЭНМ) — вещество, взаимодействующее с молекулой ДНК и вызывающее случайные мутации. Самцам мыши вводили ЭНМ, после чего в некоторых сперматозоидах возникали мутации. Затем мутантных самцов скрещивали с обычными, немутантными, самками. Родилось гетерозиготное потомство — тысячи и тысячи мышей. Этих мышей помещали в «беличьи» колёса и снимали диаграммы активности при чередовании света и темноты и в полной темноте. У всех мышей среднее значение циркадного ритма составляло 23,7 часа (стандартное отклонение 0,17 часа). Неожиданно обнаружили самца, чей суточный цикл составил 24,8 часа. Теперь нужно было понять, действительно ли у него есть дефект в каком-либо часовом гене. Этого гомозиготного самца (++) скрестили с тремя обычными гомозиготными самками (––). Получили гетерозиготных (+–) мышей потомства, этих мышей скрестили между собой, а затем снова протестировали их потомство на двигательную активность. Так удалось вывести гомозиготную (++) линию чёрных мутантных мышей с длинным циркадным циклом, которые в полной темноте становились «аритмичными». Теперь надо было определить локализацию мутантного гена, вызывающего эти изменения в суточном ритме жизнедеятельности мыши.
На то время была известна генетическая карта всех хромосом мыши и хромосомные маркеры-метки (участки хромосом), определяющие некие внешние фенотипические особенности этой линии мышей. Наличие или отсутствие генетической метки у потомков «меченых» мышей легко определялось «на глаз». Если маркер при скрещивании теряется, происходит потеря соответствующего внешнего признака. Группа Такахаши провела генетическое картирование часового гена и определила его местоположение на хромосоме. Для этого чёрных «аритмичных» мышей несколько раз скрещивали с белыми мышами, участки хромосом которых были помечены маркерами. Когда при скрещивании исчезают сразу два признака, это означает, что у потомства отсутствует участок хромосомы, содержащий сразу два маркера. Так удалось определить локализацию отсутствующего генетического участка и, следовательно, местоположение нового часового гена Clock, отвечающего за устойчивость циркадного ритма мыши.
Сегодня, когда геном мыши расшифрован полностью, определить нуклеотидную последовательность отрезка ДНК между маркерами довольно легко. Но 15 лет назад, когда проводилось это исследование, учёным приходилось секвенировать участки ДНК, содержащие часовые гены, самостоятельно.
Пятнадцать лет назад работа по определению одного мутантного гена занимала несколько лет. Теперь появился новый мощный инструмент исследований — стало возможным «выключить» какой-либо ген мыши и посмотреть, как это отражается на её поведении. Для определения одного часового гена требуется «всего» 1—2 года работы нескольких исследователей. С конца 1990-х годов было открыто целое семейство часовых генов млекопитающих: ген Bmal, работающий в паре с геном Per, гены Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 и некоторые другие.
Итак, гены, контролирующие суточную активность живой клетки, известны. А каким образом работает этот молекулярный хронометр? Рассказывает один из известных специалистов в области изучения молекулярного механизма циркадной активности, руководитель группы циркадных ритмов Института биофизической химии Макса Планка в Гёттингене (Германия) Хенрик Остер:
«В последнее время стало известно, что с небольшими вариациями «внутриклеточный хронометр» работает одинаковым образом во всех изученных клетках, включая нейроны СХЯ. Внутренние «часы» имеются не только в клетках живых существ, но и в клеточных культурах, которые выращиваются в лаборатории.
Молекулярные циркадные часы представляют собой цикл активации часовых генов, которая постепенно ослабляется через механизм обратной связи. Белки-активаторы BMAL1 и CLOCK связываются с регуляторным участком ДНК (E-box), при этом «включаются в работу» часовые гены Per и Cry (Cryptochrome). Это происходит рано утром. Через 2 часа после активации часовых генов в клетке наблюдается пик концентрации соответствующих мРНК, а к полудню нарабатывается максимальное количество белков PER и CRY. Эти белковые молекулы сначала накапливаются в клеточной цитоплазме, а в ночной период постепенно возвращаются в ядро и гасят активность белков BMAL1 и CLOCK, образуя с ними прочный комплекс, что приводит к блокировке генов Per и Cry. Потом белки PER и CRY постепенно распадаются, и молекулы BMAL1 и CLOCK высвобождаются, чтобы начать новый суточный цикл в клетке — включить часовые гены Per и Cry. Суммарная продолжительность такого циклического процесса составляет около 24 часов.
В подобном молекулярном цикле задействованы и другие известные часовые гены. Более того, 8—10% всех активных (не только часовых) генов осциллируют в суточном ритме. Например, в печени процессы гликолиза, метаболизма жирных кислот, глюконеогенез происходят с периодичностью 24 часа.
Кроме того, по последним данным, СХЯ в ответ на световой сигнал — цайтгебер посылает некие неизвестные химические сигналы, которые активируют выработку кортиколиберина, а тот в свою очередь — гипофизарного адренокортикотропного гормона (АКТГ). Концентрация АКТГ в крови колеблется циклически, достигая максимума в 6—8 часов утра. Как известно, АКТГ очень важен для организма, он стимулирует синтез глюкокортикоидов (кортизола, альдостерона и др.) в коре надпочечников, выполняет и другие регуляторные функции. Часовые гены управляют физиологией надпочечников, циклическим выбросом адреналина.
Сигнальные пути, участвующие в передаче временной информации из центрального координирующего органа — гипоталамуса — в другие места, задействованные в механизме осцилляций всех органов, пока мало изучены. Это — предмет исследований нашей группы».
***
Организм человека состоит из десятка триллионов клеток, а значит, из триллионов беззвучных биологических часов, которые отсчитывают время вне зависимости от светового дня. За их ходом неусыпно наблюдает скопление мозговых клеток — где-то на уровне переносицы — 20 тысяч нейронов СХЯ. Они отвечают за то, чтобы все часы в органах и клетках включались в работу по световому сигналу — вовремя и чётко. Для синхронизации часов организма в крови присутствуют специальные вещества, о которых пока мы знаем очень мало. Но скоро узнаем, без сомнения.
Автор выражает благодарность Хенрику Остеру за обстоятельное интервью и любезно предоставленные иллюстрации.
