В пятнадцатилетнем возрасте будущий профессор сэр Джон Гёрдон занимал самое последнее место по успеваемости в биологии среди 250 мальчиков своей группы в Итонском колледже. Шестьдесят четыре года спустя — после того как вместе с японским исследователем стволовых клеток Синъя Яманакой он получил Нобелевскую премию 2012 года по медицине и физиологии — его стали называть одним из лучших умов своего поколения.
Выступая после вручения награды, сэр Джон сказал, что школьная характеристика, выданная ему в 1949 году, до сих пор висит над его креслом в рабочем кабинете Института Гёрдона в Кембридже. В документе сообщается, что при написании контрольных тестов по биологии ему редко удавалось набрать больше двух баллов из 50 возможных и что заниматься наукой ему противопоказано. С такой характеристикой он и продолжил обучение по специальности «классическая литература» в колледже Крайст-Чёрч Оксфордского университета. Там ему разрешили сменить специализацию — перейти на зоологическое отделение. Будучи аспирантом Оксфордского университета, в 1958 году он сделал своё знаменательное открытие, то самое, о котором упоминается во всех учебных программах для биологов всех университетов мира, приоткрывшее потайную дверь в страну под названием «Регенеративная медицина». Гёрдон был первым биологом, которому удалось экспериментально доказать, что гены во всех клетках организма действительно одинаковы. Он выделил ядро из клетки эпителия кишечника шпорцевой лягушки и пересадил его в яйцеклетку другой представительницы данного вида амфибий. Результат — яйцеклетка начала делиться, и образующаяся клеточная масса проходила все классические этапы эмбриогенеза до стадии головастика. В двух процентах случаев головастики развивались во взрослых лягушек. Идея в то время была спорной, поскольку противоречила предыдущим исследованиям гораздо более известных учёных, потративших на изучение вопроса десятки лет. А тут вдруг аспирант-двоечник взял и сделал то, что никому не удавалось.
Как тут не вспомнить великого систематика и натуралиста Карла Линнея. В очерке, изданном в 1891 году, его биограф В. А. Фаусек пишет: «Он в 1727 году окончил гимназию, ректор её, Крон, в свидетельстве, выданном Линнею для поступления в университет, поместил следующую витиеватую аттестацию: “Юношество в школах уподобляется молодым деревьям в питомнике. Случается иногда — хотя редко, — что дикая природа дерева, несмотря ни на какие заботы, не поддаётся культуре. Но пересаженное в другую почву дерево облагораживается и приносит хорошие плоды. Только в этой надежде юноша отпускается в академию, где, может быть, он попадёт в климат, благоприятный его развитию”. С этой сомнительной рекомендацией в кармане Линней отправился в Лунд, ближайший университетский город Швеции».
Открытие Гёрдона можно считать фундаментом дальнейших успехов регенеративной биологии — клонирования овечки Долли шотландскими биологами Яном Вилмутом и Кейтом Кэмпбеллом в 1996 году и перепрограммирования соматических клеток в стволовые, которое смог осуществить японский исследователь Синъя Яманака в 2003 году.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) — так назвал их Синъя Яманака. В 2000 году он задался вопросом, какие факторы могут повлиять на способность специализированных (соматических) клеток превращаться в стволовые? В своих рассуждениях он исходил из предположения, что все или почти все клетки организма имеют достаточный потенциал для того, чтобы стать плюрипотентными. Такую гипотезу в 1957 году выдвинул эмбриолог Конрад Уоддингтон. Он предложил схематичную аналогию процесса развития животного организма из оплодотворённой яйцеклетки (см. рисунок). Эта аналогия известна в науке как «морфогенетический ландшафт Уоддингтона». Оплодотворённая яйцеклетка исходно обладает высоким потенциалом. Она тотипотентна (от лат. totalis — всеобщий; potentia — способность), поскольку из неё могут получиться любые клетки будущего организма. По мере развития организма у дочерних клеток потенциал снижается (условный «шарик» скатывается в одну из «долин» ландшафта), то есть теряется тотипотентность. Из дочерних клеток возникают многие типы клеток. Это состояние принято называть плюрипотентностью (лат. pluris — многое, но не всё). Соматические клетки (обычные клетки тела) уже растратили свои потенции, они находятся в «долинах» ландшафта. Для построения нового организма клетки должны либо так и оставаться на высоком морфогенетическом уровне, либо перепрограммироваться. Некоторые соматические клетки можно перепрограммировать, но только до плюрипотентного состояния. По мере делений они снова «скатятся» вдоль выбранных путей развития. В чрезвычайных обстоятельствах одни соматические клетки могут превращаться в другие, преодолевая «хребет» в морфогенетическом ландшафте. При старении и апоптозе клетка «уходит» из ландшафта. Стволовые клетки (СК), которые находятся на среднем уровне в «долинах», возможно, будет легче вернуть в плюрипотентное состояние, чем обычные соматические, — так рассуждал Синъя Яманака.
Со всей японской скрупулезностью и обстоятельностью из огромного списка известных факторов, участвующих в регуляции эмбриогенеза, он выбрал 24 гена-кандидата, которые, по его мнению, могли бы играть важную роль в перепрограммировании клеток, и принялся изучать конкретные проявления их действия.
Для этого в эмбриональные фибробласты мыши (клетки соединительной ткани, которые часто культивируют in vitro в лабораториях) вводили генетические конструкции на основе ретровирусных векторов, а также ген устойчивости к антибиотикам, который мог включаться только в том случае, если был активен ген Fbxo15 — один из генов плюрипотентности. Яманака предполагал, что этот ген обязательно включится, если клетки приобретут свойства плюрипотентности под воздействием любой комбинации из 24 исследуемых факторов.
Гены-кандидаты вводили в фибробласты по отдельности, но клетки не хотели расти на среде с антибиотиками, то есть ген плюрипотентности Fbxo15 был неактивен. Когда исследователи приготовили смесь, в которой присутствовали все 24 гена-кандидата, и ввели её в клетки, на питательной среде с антибиотиком доксициклином выросло сразу несколько клеточных колоний. К своему удивлению, учёные обнаружили, что только четыре гена были действительно необходимы для образования колоний стволовых клеток. Все они оказались транскрипционными факторами, то есть основная их функция в организме — регулировать процесс считывания информации с ДНК. Эти гены, а именно Oct3/4 (также известный как Pou5f1), Sox2, Klf4 и с-Myc, могли перепрограммировать фибробласты мышиных эмбрионов и взрослых особей в ИПСК.
Перепрограммированные клетки были похожи на эмбриональные стволовые клетки по своему внешнему виду (морфологии), экспрессии генов-маркеров СК, а также по способности формировать тератомы (опухоли, состоящие из тканей различных типов). Тем не менее в первых опытах всё же не удалость полностью вернуть клетки в плюрипотентное состояние. Но в конечном итоге, усовершенствовав метод, в лаборатории Яманаки смогли получить ИПСК, пересадить их в мышиный эмбрион и вырастить химерную мышь. В 2007 году Яманаке удалось перепрограммировать фибробласты человека, слегка изменив комбинацию необходимых для этого генов.
Но всё же заставить клетки изменить программу оказалось не так-то просто. На начальных этапах лишь одна из 2000 клеток «поддавалась» и дедифференцировалась, некоторые из них после этого быстренько возвращались к своему обычному состоянию. Со временем удалось повысить эффективность индукции сначала в 10 раз, а потом и более. Во многих лабораториях учёные стали повторять эксперименты Яманаки и подбирать условия для перепрограммирования клеток печени, лимфоцитов, слизистой оболочки желудка, кожи, нервной ткани. Оказалось, что основные принципы, открытые в лаборатории Яманаки, универсальны. Развивая метод, удалось показать, что некоторые химические вещества, например вальпроевая кислота, повышают эффективность перепрограммирования. Вместе с тем некоторые клетки проявляют индивидуальные особенности. Например, для превращения клеток нервной ткани в ИПСК достаточно лишь одного фактора — Oct3/4. Для переноса генов индукции плюрипотентного состояния стали применять и другие векторы — аденовирусы, лентивирусы, белки-трансдукторы, способные доставить генетическую конструкцию через мембрану внутрь клетки.
Сам Синъя Яманака в статье, опубликованной в «Nature» в 2009 году, писал, что технология получения ИПСК по-прежнему находится в зачаточном состоянии. Тем не менее её потенциал огромен. ИПСК могут дать ответ на многие вопросы, связанные с пониманием патогенеза заболеваний и разработкой безопасных и эффективных препаратов против них. Кроме того, клеточные технологии с использованием ИПСК помогут осуществить лечение широкого спектра заболеваний и травм методом трансплантации. Это лучший способ решения этических проблем (поскольку пациент сам решает, можно ли использовать его собственные клетки) и проблем, связанных с отторжением трансплантата, вызванным иммунным ответом (реакции отторжения при пересадке собственных клеток полностью исключаются). Но для практической реализации таких методов лечения необходимо добиться полного и равномерного перепрограммирования соматических клеток в ИПСК. Кроме того, пока не удаётся достигнуть устойчивой дифференцировки ИПСК обратно в соматические клетки, а это в значительной мере увеличивает риск возникновения опухолей — тератом. Стохастическая модель Уоддингтона предсказывает, что ИПСК могут быть получены из различных соматических клеток различными методами. И необходимо продолжать поиски наиболее безопасных из них.
Год назад, в декабре 2011 года, выступая в редакции журнала «Наука и жизнь» на встрече в рамках медиаклуба «Высокие технологии» (см. журнал «Наука и жизнь» № 2, 2012 г.), заместитель директора по науке Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН доктор биологических наук Андрей Васильев сказал: «Синъя Яманака — великий японец, который получит Нобелевскую премию. Он сумел обернуть развитие вспять настолько, что обычная соматическая клетка стала аналогична клетке внутренней массы бластоцисты, ранней стадии развития зародыша». Это позволяет надеяться, что можно заставить клетку перейти из одного дифференцированного состояния в другое, минуя «плюрипотентную яму». То есть напрямую получить из одного типа ткани другой. И этот подход станет реальностью через каких-нибудь 7—10 лет.
***
Джон Гёрдон родился 2 октября 1933 года в Великобритании. В 1958 году защитил диссертацию, темой которой была трансплантация ядер клеток шпорцевых лягушек. В 1962—1971 годах работал на кафедре зоологии Оксфордского университета, в 1971—1983 годах — в лаборатории молекулярной биологии Кембриджского университета. В 1989 году Гёрдон основал Институт клеточной биологии и онкологии в Кембридже, который возглавил и который впоследствии был назван его именем. С 2001 года — научный сотрудник института.
Синъя Яманака родился 4 сентября 1962 года в Хигасиосаке, Япония. В 1987-м получил высшее медицинское образование в Университете Кобэ, Япония. В 1993 году защитил диссертацию по фармакологии в Высшей школе Университета Осаки, Япония. В 1993—1996 годах работал в Институте сердечно-сосудистых заболеваний Гладстона, Сан-Франциско, США. В 1996—1999 годы — профессор-ассистент в Медицинской школе Университета Осаки. В 1999—2005 годах работал в Институте науки и технологий Нара. С 2005 года и по настоящее время Синъя Яманака — профессор Института передовых медицинских наук в Киото.
