Ответы на эти вопросы дают эксперименты, проведённые в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН вместе с японскими коллегами. Рассказ об этих экспериментах и их результатах начнём немного издалека.
Превращения энергии, будь то в химической реакции или в каком-то физическом процессе, сопровождаются выделением тепла. В живой клетке таких реакций и процессов происходит великое множество. Вот один из примеров: на клеточных мембранах обычно формируется так называемый ионный градиент концентрации, когда каких-нибудь ионов (например, Ca2+) по одну сторону мембраны очень много, а по другую — очень мало. Когда приходит пора подать сигнал внутриклеточным биомолекулам или же что-то сообщить наружу, другим клеткам, в мембране открывается канал, через который ионы потоком движутся оттуда, где их много, туда, где их мало; и именно такое ионное движение выполняет нужную биохимическую и биофизическую работу. Накапливание ионного градиента и его разрядка по физико-химическим законам должны сопровождаться повышением температуры, то есть мембраны и мембранные молекулы, обслуживающие ионную кухню, работают как мгновенные источники тепла. Можно ли это тепло измерить?
Мы знаем, что температура — термодинамическая характеристика, она описывает состояние большого числа частиц. Грубо говоря, если частиц много и они двигаются быстро, а значит, обладают высокой энергией, то вся система будет горячей. Если двигаются медленно — холодной. Что касается клетки, то может показаться, что частиц там слишком мало, чтобы мы могли измерить их температуру.
На самом деле всё не так. Если мы возьмём, например, один кубический микрометр воды (объём, почти неразличимый глазом), то сможем насчитать в нём около 30 млрд молекул. Это огромное число, и у системы из 30 млрд частиц конечно же есть своя температура. Физическая теория давно позволяет описывать микросистемы с помощью температурного параметра; большую роль здесь сыграли работы основоположника неравновесной термодинамики, выдающегося учёного Ильи Пригожина — бельгийского физика и физикохимика российского происхождения, лауреата Нобелевской премии по химии 1977 года. Но почему же в таком случае до недавнего времени никто не предпринимал целенаправленных попыток измерить локальные внутриклеточные температурные эффекты?
Когда мы имеем дело с большим объектом, например с чайником кипящей воды, то вода в нём остывает медленно. Тепло, накопленное водой, не может быстро уйти в воздух, потому что вода и воздух по-разному проводят тепло. Для описания того, что происходит с температурой в таких системах, существует специальный физико-математический аппарат на основе равновесной термодинамики. Но кипящий чайник и воздух на кухне — это «большие» системы. А если у нас всего микролитр воды или того меньше — живая клетка? Мы только что сказали, что с молекулярной точки зрения микролитр воды — система с огромным числом частиц, обладающая собственной температурой. Однако есть важный нюанс: представим, что в каком-то месте внутри клетки произошла реакция, сопровождающаяся выделением тепла. Нагреется ли хоть на сколько-нибудь окружающая среда, почувствуют ли её частицы пришедшее к ним тепло? Появится ли в клетке так называемый температурный градиент, когда рядом находятся две области с разным количеством тепла и тепло из одной перетекает в другую так, что мы можем это измерить? Прежние расчёты говорили о том, что мощность источников тепла в живой клетке слишком мала, чтобы создать в ней местные градиенты температур. То есть локальные температурные скачки будут происходить, но не настолько большие, чтобы повлиять на внутриклеточные процессы.
В последние пару десятилетий стало ясно, что такие термодинамические расчёты, видимо, не применимы для микросистем. Например, электронные устройства могут нагреваться довольно сильно, и, когда начали исследовать, как именно нагреваются компьютерные процессоры, оказалось, что в их полупроводниковых микро- и наноструктурах температурные градиенты получаются значительно выше, чем можно было ожидать. Почему так происходит? Потому что прежде не учитывали сложную микроструктурированность среды тех самых полупроводников. Это в чайнике всё сравнительно просто: даже если мы кипятим сложный с химической точки зрения раствор солей, он всё равно однородный, и можно сказать, что тепло распространяется по всему объёму более или менее равномерно. А если мы имеем дело со сложноорганизованной структурой, то тепло в разных участках её распространяться будет по-разному. В качестве примера того, насколько структура вещества может влиять на теплопроводность, можно привести углеродные нанотрубки: вдоль их оси теплопроводность составляет 1750…5800 Вт/(м·K), а вот если пустить тепло перпендикулярно оси, теплопроводность окажется всего около 0,02…0,07 Вт/(м·K), то есть на пять порядков ниже!
Если мы заглянем внутрь живой клетки, то обнаружим в ней вовсе не гомогенный раствор белков, липидов и пр. — мы увидим множество органелл, внутриклеточных мембран, больших молекулярных комплексов. Сравнение компьютерных процессоров с клетками покажется тем более логичным, если мы сопоставим их электродинамические характеристики. Известно, что разность электрических потенциалов на плазматической мембране (обусловленная распределением ионов по обе её стороны) составляет приблизительно 100 мВ. С поправкой на разницу в толщине это примерно та же напряжённость поля, которая существует в наноструктурах микропроцессоров, а ведь в процессорах такое поле приводит к значительным тепловым эффектам. Если где-то рядом с липидной мембраной случится выброс тепла, то, как и в процессоре, оно здесь задержится на некоторое время, потому что сама мембрана и молекулярные комплексы, плавающие рядом с тепловым очагом, будут отводить тепло не так быстро, как это происходило бы в однородном растворе.
Получается, что клетка из-за своей сложной внутренней структуры должна быть буквально нашпигована локальными тепловыми очагами, то возникающими, то угасающими. Тут стóит вспомнить, что химические и физические реакции не только сами выделяют тепло, но и зависят от окружающих температурных условий: например, есть процессы, которые при высоких градусах идут быстрее, а есть и другие, которые, наоборот, при нагревании замедляются. Очевидно, температурные перепады между разными частями клетки или между самой клеткой и её ближайшим окружением должны сильно влиять на клеточную физиологию. Чтобы проверить, так ли оно на самом деле, надо уметь не только измерять температуру внутри одной-единственной клетки, но и нагревать её, чтобы посмотреть, как она отреагирует — если вообще отреагирует.
Именно это удалось сделать кандидату физико-математических наук Вадиму Цеебу и его коллегам из Института теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ) Российской академии наук вместе с сотрудниками японского Университета Васэда. Их нанонагреватель делается сравнительно просто. Берётся суспензия наночастиц алюминия, диаметр которых составляет около 100 нм. В суспензию на пару секунд опускают кончик (диаметром около микрометра) обычной стеклянной микропипетки. Водная суспензия попадает в кончик пипетки, который затем подносят к нагревателю: вода испаряется, а наночастицы остаются. Затем кончик пипетки подводят ещё ближе к нагревателю, чтобы он оплавился — в результате внутри микропипетки оказываются запаянными несколько наночастиц алюминия. Вообще, в качестве «наполнителя» для нанонагревателя могут выступать и другие металлы — платина, серебро, золото. Выбор алюминия был связан лишь с тем, что его наночастицы слабо слипаются друг с другом.
Именно металл будет греть клетку, а чтобы разогреть сами наночастицы, нужен инфракрасный лазер с длиной волны 1064 нм — его излучение не поглощают ни вода, ни стекло, поэтому вся энергия излучения уйдёт в алюминий. Удерживая лазерный луч на кончике нанонагревателя, можно буквально за миллисекунды получить крутой температурный градиент — из-за малой теплопроводности воды всё тепло будет выделяться в наночастицах.
Но это нагреватель, а что термометр? Он устроен похожим образом и представляет собой запаянную микропипетку с термочувствительным флуоресцентным веществом: в зависимости от температуры вещество флуоресцирует на разных частотах. Когда мы подносим кончик термометра к кончику нагревателя, молекулы в кончике термометра чувствуют тепло и начинают светиться иначе. Естественно, нагреватель и термометр испытали сначала без клеток, в чистой воде, и уже в таких предварительных экспериментах удалось получить интереснейший результат. Когда наночастицы разогревали до 100оС, на нагревателе появлялся пузырёк насыщенного пара — проще говоря, вода рядом с ним вскипала. Но уже на расстоянии всего 20 мкм температура падала до 30оС, после чего медленно снижалась до 24оС. (Для сравнения: размер митохондрий, важнейших органелл клетки, которые добывают для неё энергию и в которых протекает огромное число реакций, составляет от 0,5 до 10 мкм.) Как раз в таких случаях и говорят, что имеет место крутой температурный градиент: поскольку вода плохо проводит тепло, то уже в ближайших окрестностях нанонагревателя температура оказывается на целых 70оС ниже. И даже если лазер будет всё время поддерживать на наночастицах температуру 100оС, температурный градиент никуда не денется.
Почему мы так много говорим о температурном градиенте? Представим, что нанонагреватель со 100оС на кончике приблизился к клетке. Ей, конечно, от этого не поздоровится. Но её соседки ничего серьёзного не почувствуют, в худшем случае — потепление на несколько градусов: градиент-то крутой, температура по мере отдаления от нагревателя очень быстро падает. А теперь представим, что убитая клетка была раковой, а её соседки — обычными, здоровыми. Если бы у нас в руках оказался такой температурный скальпель, можно было бы исключительно точно ликвидировать очаги злокачественных опухолей, нисколько не вредя окружающим здоровым тканям. (Особенно учитывая то, что опухоли хуже переносят термический стресс.)
Но прежде чем фантазировать по поводу применения нового метода, хорошо бы узнать, чем продолжились опыты с нанонагревателем. Установку испытали с человеческими клетками, в которых создавали градиент температур, а самим клеткам давали краситель, чувствительный к содержанию ионов кальция. Как мы помним, различные ионы, в том числе и кальциевые, распределены по клетке неравномерно: специальные белки перекачивают их в те или иные органеллы либо в цитоплазму, и если говорить о кальции, то он скапливается в сложной системе мембранных пузырьков и трубочек, которая называется эндоплазматической сетью или эндоплазматическим ретикулумом. Оказалось, что нагревание и последующее охлаждение стимулируют мощный выброс ионов кальция из эндоплазматической сети в цитоплазму, что было видно по окраске чувствительного к кальцию красителя, который тоже плавал по цитоплазме.
Это может показаться простым опытом, и непонятно, зачем нужно было создавать нанонагреватель: почему бы просто не нагревать клетки в питательной среде, одновременно глядя на них в микроскоп? Но, во-первых, при общем нагревании клетки просто уплывали бы из фокуса микроскопа из-за теплового расширения материалов. А во-вторых, выброс кальция происходил при очень-очень быстром охлаждении: после выключения лазера градиент температур исчезал буквально за миллисекунды. Такой сверхбыстрый тепловой скачок невозможно было бы устроить, просто нагревая клеточную культуру.
Попутно исследователи обнаружили, что для кальциевого эффекта клетки нужно греть по-разному в зависимости от температуры среды и самый слабый нагрев нужен при 36,6оС. Иными словами, если клетки живут при нормальной температуре человеческого тела, они наиболее чувствительны к температурным колебаниям; получается, что наш организм термически настроен на максимальную эффективность выброса Са2+. Эти результаты Цееб и его японские коллеги опубликовали в 2009 году в «HFSP Journal».
Ещё более интересный результат экспериментов с нанонагревателем состоит в том, что с его помощью можно управлять ростом клеток. Так, если рядом с нейроном оказывалась «горячая точка», то нейронные отростки начинали расти в её сторону со скоростью около 10 мкм в минуту. Похожим образом вели себя и клетки других типов: почувствовав тепло, они выпячивались в его сторону. Форма любой клетки зависит от архитектуры её цитоскелета, сформированного несколькими специальными белками. Было показано, что и в нейронах, и в других клетках цитоскелет в ответ на тепло начинает перестраиваться. Всё происходило опять же под действием точечного, ультралокального градиента температур, который можно было создать только с помощью нанонагревателя — в случае большого источника тепла просто не получилось бы создать перепад температур в объёме, сравнимом с размером самой клетки. Результаты экспериментов с нейронами были опубликованы в 2015 году в журнале «Scientific Reports».
Не стоит долго объяснять, что за перспективы открываются для биологии. Во-первых, известно, какую огромную роль для клетки играют трансмембранные ионные потенциалы; можно вспомнить и про митохондрии, которые с помощью потока ионов через специальный мембранный фермент синтезируют для клетки энергетические молекулы, и про нейроны, которые генерируют нервный импульс именно благодаря неравномерному распределению ионов по обе стороны клеточной мембраны. Действуя на клетку тепловыми импульсами, мы можем больше узнать о самых фундаментальных процессах в её физиологии. Во-вторых, если тепло настолько сильно влияет на клеточный рост, то легко представить, как такой нанонагреватель можно использовать в регенеративной медицине, где часто бывает нужно восстановить повреждённые отростки у нервных клеток или вообще заставить клетки расти в определённую сторону. Кроме того, температурный градиент можно использовать в другом высокотехнологичном методе — методе 3D-печати, где сейчас активно осваивают печать живыми клетками.
Конечно, мы сейчас уже очень много знаем о том, как температура влияет на клетку. Но до сих пор исследовали преимущественно либо отдельные физико-химические реакции, либо целые клеточные культуры. В последнее время в биологии активно развиваются методы, которые позволяют исследовать поведение отдельно взятых клеток и отдельно взятых молекул, так что в этом смысле описанные эксперименты находятся на самом переднем крае биологической науки. А поскольку многие тепловые эффекты происходят в клетке очень быстро, то с помощью нового метода мы как раз в состоянии увидеть, что происходит при мгновенном разогревании и мгновенном остывании очень небольшого объёма цитоплазмы клетки или окружающей её среды.
Впрочем, говоря о «новом методе», нужно уточнить, что опубликованным недавно удивительным данным по скоростному росту нейронов предшествовали годы работы, — первые статьи Вадима Цееба и его коллег на тему «нанонагревания» выходили в научной периодике ещё в первой половине 2000-х годов. Прибор, созданный исследователями для импульсного нагревания клеток, оказался сравнительно недорогим, и сейчас, когда уже стало понятно, что он может дать биологии и медицине, хотелось бы надеяться, что и сам метод, и прибор к нему найдут самое широкое применение в современной науке.
