Крио-электронная микроскопия: как увидеть больше

Ведущие мировые специалисты поделились с молодыми петербургскими учеными опытом в области одной из самых передовых технологий клеточной и молекулярной биологии.

Рассказывая о тех или иных открытиях и исследованиях, мы часто упускаем из виду те методы и приборы, с помощью которых ученые получают результаты. Инструментами науки и в XXI веке могут быть обычная линейка, лупа или калькулятор. Но ничто не стоит на месте, и сейчас с помощью ультрасовременных приборов можно увидеть и отдельные атомы и глубины космоса, которые удалены от нас на миллионы километров.  Правда, пользоваться такими приборами намного сложнее, чем линейкой и лупой.

Настоящий ученый все время чему-то учится. Недавно в Ресурсном центре развития молекулярных и клеточных технологий СПбГУ прошла Школа «Методы крио-электронной микроскопии и пробоподготовки». Студенты и научные сотрудники под руководством ведущих мировых специалистов в области пробоподготовки учились работать на сложнейших приборах. Конечно, за несколько дней невозможно освоить все методики, а вот понять, как это работает и какие исследования можно проводить представленными методами,  — вполне.

Крио-электронная микроскопия сегодня — один из ведущих методов исследования в клеточной и молекулярной биологии. Нобелевская премия по химии в 2009 году была вручена Тому Стайцу, Венкатраману Рамакришнану и Аде Йонат за определение структур рибосомы именно с помощью крио-электронной микроскопии.

  Мембранный транспорт, за исследования которого присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине в этом году Рэнди Шекману, Джеймсу Ротману и Томасу Зюдофу,  в наши дни также исследуется при помощи методов, о которых идет речь.

Преимущество метода Токуясу, названного по имени ученого, который его разработал — Киотеру Токуясу (Kiyoteru Tokuyasu), в том, что исследуемая ткань после обработки и изготовления тончайших срезов сохраняет свою иммуногенность, то есть способность чужеродного антигена вызвать иммунный ответ организма. Интересующие исследователя биомолекулы можно пометить антителами с наночастицами золота и затем под микроскопом увидеть распределение меченых молекул.

При работе на таком микроуровне, как внутреннее строение клетки, очень важно не повредить объект, сохранить его первоначальную структуру. «Классические методы электронной микроскопии требуют использования специальных веществ, фиксирующих агентов, которые сшивают между собой белки. В этом случае обеспечивается хорошая сохранность образца, однако такая обработка приводит к ряду артефактов, например, потери межклеточных пространств. В связи с этим возрастает популярность фиксации при помощи замораживания объекта. При обычных условиях заморозки вода формирует кристаллы льда, которые повреждают образец. Существует несколько подходов, позволяющих избежать кристаллизации. Первый подход — использование веществ, препятствующих замерзанию при низких температурах, например, сахарозы, как в методе Токуясу. Второй подход — использование специальных условий: мгновенного охлаждения и повышенного давления. В таком случае образец может быть заморожен в так называемом «витрифицированном» состоянии в аморфном льду, когда кристаллическая решётка льда не успевает сформироваться и образец со всеми проходившими в нем процессами оказывается одномоментно зафиксирован. При крио-условиях из получившегося образца можно сделать срезы, можно заменить воду на органический растворитель. При этом максимально сохраняется как структура образца, так и его иммуногенность.

В случае, если необходимо исследовать отдельные белковые комплексы, фаги, вирусы и даже мелкие бактерии, можно заморозить их целиком на специальной сеточке, без необходимости изготовления срезов.  Это может быть важно, например,  в определении механизма проникновения вируса в клетку и зависимости конформации поверхностных белков от таких факторов, как pH» , — разъяснил некоторые тонкости крио-электронной микроскопии директор ресурсного центра кандидат биологических наук Павел Зыкин.

Одним из преподавателей Школы стала Галина Безнусенко, сотрудник Европейского института онкологии в Милане.  «Криосрезы позволяют на ультраструктурном уровне производить двойное и тройное мечение. То есть чтобы охарактеризовать положение белка в клетке, можно одновременно пометить и сам белок, и те компартменты, между которыми он перемещается, например эндоплазматический ретикулюм и аппарат Гольджи. При комнатной температуре это сделать сложно из-за необходимости сильной химической фиксации материала, что уменьшает вероятность распознавания этих белков специфическим антителом. Сейчас такие исследования очень востребованы, о чем свидетельствует и присужденная в этом году Нобелевская премия по физиологии и медицине как раз за изучение внутриклеточного транспорта. Понимание механизмов внутриклеточного транспорта необходимо для изучения любого процесса, происходящего в организме, представления как именно действуют те или иные лекарственные препараты и почему возникают заболевания, связанные с обменом веществ, —  рассказала Галина о том, почему криомикроскопические методы так важны для медиков и биологов, —  к примеру, есть такое тяжелое заболевание — муковисцидоз. В результате мутации белок,  участвующий в транспорте ионов хлора через мембрану клетки, не выходит из эндоплазматического ретикулюма, что в итоге приводит к нарушению работы целого ряда органов. Есть и другие заболевания, в основе которых лежит нарушение внутриклеточного транспорта. Поэтому так важно владеть самыми передовыми методиками, позволяющими изучать все эти процессы».

Оснащение ресурсного центра Галина Безнусенко оценила очень высоко. Но отметила и ряд недостатков — очень плотное размещение оборудования, недостаток рабочих поверхностей для подготовительной работы. При работе с такими тонкими во всех смыслах материями микроклимат, циркуляция воздуха, наличие свободных столов для работы, крайне важны. Если потоки воздуха направлены не так как нужно, то очень сложно получить хороший срез.

В работе Школы принял участие и Гельмут Гнэги (Helmut Gnaegi) — легенда ультратомии. В свое время, еще в 1970-е годы, он разработал систему заточки алмазных ножей, которые позволяют получать серийные срезы толщиной всего несколько десятков нанометров. Гнэги показал, как следует обращаться с алмазными ножами и как получать с их помощью серийные срезы.

На фото:
3. Поперечный срез головы Caenorhabditis elegans полученный с использованием метода криофиксации. Эта свободноживущая нематода длиной около 1 мм давно стал излюбленным модельным объектом — первым многоклеточным организмом, чей геном был полностью расшифрован, на C. elegans  были проведены исследования зеленого флуоресцентного белка, а примитивное устройство червя (взрослая особь состоит из всего лишь 952 клеток) стала прообразом для моделирования первого виртуального организма (Courtesy T. Muller-Reichert and Kent McDonald)