Молекула аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - универсальный микроаккумулятор энергии в клетке. Именно из этого источника у животных и человека черпается энергия и при сокращении мышц и при проведении сигнала через нейрон и при синтезе молекул белка, иными словами - при любых жизненных отправлениях.
Публикуемая статья рассказывает об одном из путей, по которому идут биологи в поисках ответа на вопрос, каким образом клетка синтезирует молекулу АТФ.
Доктор биологических наук А. ЯСАИТИС, и сотрудник отдела биоэнергетики Межфакультетской лаборатории МГУ С. ОСТРОУМОВ.
В последнее время научная проблематика, объединяемая под названием «биоэнергетика», привлекает все возрастающее внимание исследователей. За одно пятилетие появились три международных журнала по биоэнергетике. Все чаще созываются международные специализированные симпозиумы и конференции, обобщающие непрерывный поток экспериментальной информации по этой тематике. Смысл термина «биоэнергетика» в принципе не требует специального разъяснения. Он включает в себя многие аспекты обеспечения жизненных процессов энергией. Наш рассказ облегчается, однако, тем, что под флагом биоэнергетики в настоящее время сгруппировались исследователи, которых волнует лишь вполне определенный и относительно узкий круг вопросов энергетики жизни в целом.
Введение самого слова «биоэнергетика» в научную терминологию напоминает историю термина «кибернетика». Как известно, Н. Винер в свое время опубликовал полу-популярную книгу с изложением своих идей относительно проблем управления и название книги - «Кибернетика» - быстро завоевало популярность в качестве имени нового научного направления.
Аналогичную судьбу имела монография лауреата Нобелевской премии А. Сент-Дьерди, вышедшая в 1957 году под названием «Биоэнергетика». Книга, очень ярко и интересно написанная, содержала мысли (именно мысли!) автора о процессе мышечного сокращения, об энергетическом состоянии биологических возбудимых молекул, сетования относительно неспособности традиционных химических формул отразить энергетику биохимических реакций, откровенные заявления крупного биохимика о незнании многих аспектов энергетики жизни.
С легкой руки Сент-Дьерди биоэнергетикой назвали оформлявшуюся тогда довольно четко очерченную область биохимии и биофизики, занятую решением совершенно конкретного вопроса, каким образом клетка синтезирует молекулы аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ)?
В этом относительно простом химическом соединении, в сущности, кроется энергия солнечных лучей, захваченная фотохимическим аппаратом зеленого листа и готовая в любой момент, по словам К. А. Тимирязева, «привести в движение и кисть художника и перо поэта»
Попытаемся проследить путь энергии от солнечного луча до биологического микроаккумулятора - АТФ.
В основе всех жизненных процессов, включая превращение энергии, лежит хорошо налаженная работа катализаторов химических реакций - ферментов - веществ, которые заставляют реакции идти в живой клетке в условиях обычной температуры и давления и притом с огромной скоростью. Довольно привычным стало, что эти биокатализаторы очень эффективно направляют химические реакции в клетке по пути, маловероятному, с точки зрения химика-синтетика, если он не будет учитывать тот факт, что в живой клетке (именно пока она живая) существуют строжайшие запреты, исключающие наиболее вероятные реакции. Именно на такого рода запретах в первую очередь и зиждется энергетика клетки, ибо наиболее вероятные химические реакции отличаются таким огромным количеством выделяющейся тепловой энергии, что в «топливном» хозяйстве клетки это было бы равносильно необратимой утрате благоприобретенных солнечных лучей.
Первый такого рода запрет начинает действовать при взаимодействии света с молекулой хлорофилла. Если хлорофилл перенести из листа в пробирку, то возбужденный электрон этого пигмента мгновенно возвратится на свой исходный энергетический уровень, излучая полученную солнечную энергию в виде света и тепла - явление, наиболее вероятное с точки зрения фотохимика. Но зато в естественных условиях, то ость в зеленом листе, возбужденный электрон хлорофилла улавливается определенными химическими центрами, в результате чего он, сохраняя свой энергетический уровень, довольно прочно «оседает» в специализированной молекуле пиридиннуклеотида. Это явление, несмотря на всю его необычность с точки зрения термодинамики фотохимических реакций, представляется совершенно нормальным для биохимика.
Термодинамические неожиданности на этом не кончаются. Электрон в составе восстановленной молекулы пиридиннуклеотида по своему энергетическому потенциалу можно приравнивать к электрону в составе молекулярного водорода, который, взаимодействуя-с кислородом, дает известную реакцию взрыва гремучего газа.
Дело в том, что процесс окисления биохимических соединений, то есть передача электронов от этих соединений к другим молекулам (например, кислороду) протекает с выделением энергии. Количество этой энергии неодинаково в случае окисления различных соединений. Окисление пиридин-нуклеотида (то есть отдача им электрона) сопряжено с освобождением значительно большего количества энергии, чем в случае многих других биохимических окислительных процессов. Энергия эта в клетке обычно не пропадает зря, а используется на нужды организма. Поэтому электрон так называемой восстановленной (то есть способной к дальнейшему окислению) формы пиридиннуклеотида имеет высокую энергетическую стоимость. Немало таких «дорогих» электронов, а заодно и затраченных средств теряется, пока восстановленный пиридиннуклеотид в виде препарата транспортируется с завода-изготовителя в биохимическую лабораторию дело в том, что, пиридиннуклеотид окисляется кислородом и излучает солнечную энергию в виде тепла.
Клетка же обращается со своим «золотым фондом» исключительно бережливо - расходует энергию электрона для осуществления жизненных процессов, достигая при этом коэффициентов полезного действия, подчас недоступных самым современным техническим средствам.
Пиридиннуклеотид, принявший электрон и вместе с ним энергию, не самая удобная форма ее хранения. И потому в последующих реакциях (их называют темновыми реакциями фотосинтеза) пиридиннуклеотид отдает электрон в составе атома водорода для строительства молекулы углевода. Именно углеводы образуют кладовую солнечной энергии.
Биохимические реакции синтеза углеводов на основе фиксации СО2 очень сложны. Для того, чтобы эта громоздкая ферментная фабрика фиксировала СО2, требуется энергия. Она поставляется, как и при других процессах синтеза в клетке, специальным биологическим микроаккумулятором - молекулой АТФ.
Аккумуляция энергии солнца и последующая передача ее клеткам животных связаны с двумя типами (цепями) переноса электронов. Первая цепь действует при фотосинтезе (см. рис.), причем перенос совершается в хлоропластах растений и заканчивается синтезом молекулы углевода из углекислоты и водорода. Вторая цепь (при дыхании) функционирует в других субклеточных органеллах 1 - митохондриях животных и растений, которые служат для окисления молекул углеводов, в результате чего накопленная в них энергия преобразуется в энергию новых молекул АТФ.
Эту вторую цепь переноса электронов называют также дыхательной цепью, поскольку в биохимии дыханием называют комплекс явлений, связанных с поглощением кислорода суспензией клеток или субклеточных структур. Решающий вклад в это поглощение кислорода вносит именно деятельность митохондриальной цепи переноса электронов, которая продуцирует электроны, далее принимаемые кислородом. Благодаря тому, что в среде содержатся ионы водорода, в конечном счете образуются молекулы воды. Так происходит поглощение кислорода, то есть дыхание в биохимическом смысле.
При сравнении функционирования хлоропластов и митохондрий обнаруживается интересная симметрия. В хлоропластах фотосинтетический поток электронов начинается с отделения электрона от молекулы воды и заканчивается принятием электрона молекулой пиридиннуклеотида. Затем электрон в составе атома водорода, как уже сказано, передается молекуле углевода. В митохондриях процесс, получивший название дыхательного, работает, как бы в обратном направлении восстановленный пиридиннуклеотид, то есть обладающий возбужденными электронами, возникающий при подготовительных превращениях углеводов, отдает электроны и они, пройдя по цепи дыхательных переносчиков, в конце концов оказываются в составе молекул воды. В этом заключительном акте происходит соединение электронов с ионами водорода и кислородом (вот один из результатов нашего дыхания).
При фотосинтезе необходимо восполнять убыль электронов, происходящую из-за отдачи водорода пиридиннуклсотиду. Именно поэтому в начале фотосинтетической цепи происходит расщепление молекулы воды с выделением кислорода. Так возник почти весь кислород атмосферы.
Что представляют собой фотосинтетическая и дыхательная цепи и их отдельные звенья? На этот вопрос еще нет исчерпывающего ответа. Многое все-таки уже известно, например, отдельными компонентами цепей служат белки-ферменты, среди которых важное место занимают цитохромы, а также пиридиннуклеогиды, хиноны, флавины и весьма своеобразные соединения железа и серы в комплексе с белками. Многие из этих переносчиков хорошо изучены в биохимическом отношении, в большинстве случаев известны те части их молекул, которые принимают и отдают электроны. Известна также последовательность взаимодействия отдельных переносчиков при транспортировке электрона от пиридиннуклеотида к кислороду.
Понятно теперь и то, какую функцию имеет множественность переносчиков. Благодаря этому энергия при переносе электронов от пиридиннуклеотида к кислороду высвобождается не вся сразу, а ступенчато, небольшими порциями. Именно такие сравнительно небольшие дозы энергии запасаются при отдельных актах синтеза АТФ (порядка 10 ккал/моль). Всего на пути электрона (точнее, двух электронов) к кислороду таких актов в митохондриях три.
Но вместе с тем множественность переносчиков имеет и непонятную сторону. Неясно, зачем их так много считается, что в митохондриальной цепи участвуют не менее 12 переносчиков. Зачем такая сложная машина, если энергия запасается в АТФ лишь при трех актах переноса? Неясны также механизмы передачи электрона от одного переносчика к другому.
Как уже упоминалось, цепи переноса электронов заключены в специальных органеллах клетки - в хлоропластах и митохондриях (точнее, в мембранах органелл). Это крайне интересные структуры, по форме и размерам напоминающие бактерии. Именно это чисто внешнее сходство дало основание первым исследователям, смотревшим на них в световой микроскоп (конец XIX - начало XX века), заподозрить, что они видят бактерии, каким-то образом попавшие в клетку. О таком, казалось бы, наивном представлении вспомнили, когда в последние десятилетия обнаружили в хлоропластах и митохондриях собственные гены (ДНК) и весь биохимический аппарат, необходимый для реализации генетической информации, включая рибосомы и ферменты системы, синтезирующей белок.
Поразительно, что по некоторым характеристикам аппарат хлоропластов и митохондрий, синтезирующий белок, ближе к соответствующим системам бактерий, чем к системе из цитоплазмы тех клеток, в которых находятся эти органеллы. Хлоропласты особенно сходны с сине-зелеными водорослями, группой древних бактериоподобных организмов. Биоэнергетика бактерий и сине-зеленых водорослей в принципе та же, что у митохондрий и хлоропластов. Выявление этой общности биоэнергетического механизма у всех названных структур, по-видимому, можно считать одним из самых широких биологических обобщений, достигнутых за последние годы. В чем же суть этого общего механизма?
Одной из узловых проблем биоэнергетики была, и в, какой-то мере остается проблема связи между переносом электронов и действием ферментной системы, синтезирующей АТФ. Каким образом энергия, освобождаемая при переходе электронов от одного переносчика к другому, накапливается в АТФ?
Наиболее популярной в свое время была гипотеза, получившая название химической (точнее, гипотеза химического или конформационного сопряжения). Согласно ей, при некоторых актах переноса электронов от одного фермента к другому образуется неизвестное соединение, которое обладает макроэргической (высокоэнергетической) связью. Затем эта связь распадается и за счет выделившейся энергии синтезируется еще одно макроэргическое соединение. В конце концов распад макроэргической связи одного из таких таинственных соединений приводит к синтезу макроэргической связи АТФ.
Значительный вклад в решение проблемы энергетического сопряжения внес английский биохимик П. Митчел. В 1966 году он опубликовал небольшую книжку, изданную с помощью ротапринта, под названием «Хемиосмотическое сопряжение при окислительном и фотосинтетическом фосфорилировании». Некоторые идеи этой книги были сформулированы автором еще в 1961 году. Гипотеза, которую выдвинул Митчел, постепенно привлекала все большое внимание и оказалась главной в решении проблемы.
Согласно схеме Митчела, для накопления энергии в АТФ нет необходимости в промежуточных макроэргических соединениях. Роль промежуточного звена выполняет электрическое поле на мембране и создается оно за счет энергии переноса электронов. Выглядит это так с одной стороны мембраны - положительный заряд, с другой - отрицательный. Кроме электрического поля, мембрана несет градиент концентрации ионов водорода. Эти два градиента - электрический и концентрационный - и есть непосредственные источники энергии для синтеза АТФ.
Одним из решающих доказательств правильности предположений Митчела стали опыты, проведенные в нашей лаборатории под руководством В. П. Скулачева и группой Е. А. Либермана в Институте биологической физики АН СССР. Постулированный Митчелом мембранный потенциал проявил себя, как движущая сила электрофореза, то есть переноса в электрическом поле заряженных соединений через мембраны митохондрий, бактерий и хлоропластов. Источниками энергии для такого рода электрофореза могут быть и поток электронов в цепях окислительно-восстановительных катализаторов и АТФ, добавленная в суспензию упомянутых субклеточных образований. Последнее обстоятельство не было неожиданным, поскольку давно известно, что АТФ может отдавать свою энергию для переноса электронов в обратном направлении - от более низкого к более высокому энергетическому уровню.
Здесь небезынтересно отметить, что мембраны митохондрий, хлоропластов и бактерий - прекрасные изоляторы. Если учесть, что их толщина равна 80 ангстремам, а разность электрических потенциалов, измеренная экспериментально, 200 мв, то легко рассчитать, что они выдерживают напряженность электрического поля порядка 200 тысяч вольт на сантиметр! Электрические поля такой напряженности пробивают некоторые изоляционные материалы, применяемые в радиотехнике! Дальнейшие исследования покажут, как достигается столь высокий эффект в живой клетке.
В последнее время в нашей лаборатории было проведено физическое разделение двух процессов, составляющих в сумме митчеловский механизм трансформации энергии в клетке.
В одной системе осуществляется первый процесс - создание электрического поля на мембране за счет энергии, выделяемой при переносе электронов. В другой системе происходит второй процесс - образование электрического поля за счет энергии гидролиза АТФ (расщепление на АДФ и фосфорную кислоту).
Существование второго процесса в, какой-то мере указывает на возможность не только расщепления, но, и синтеза АТФ за счет энергии электрического поля, поскольку известно, что, как синтез, так и гидролиз АТФ осуществляет один и тот же ферментативный комплекс - его называют АТФ-синтетазой или чаще, по сложившейся в биохимии традиции, АТФ-азой.
Как же было проведено разделение этих двух процессов?
После растворения митохондриальной мембраны так называемыми детергентами были получены в очищенном виде фермент цитохромоксидаза (компонент конечного участка дыхательной цепи) и белок АТФ-азного комплекса - ферментативной системы, осуществляющей собственно аккумуляцию энергии в молекуле АТФ, а именно синтез АТФ из АДФ, и фосфорной кислоты. Эти ферментативные комплексы были соответствующим образом встроены в искусственную мембрану, приготовленную из фосфолипидов (сложные жиры, входящие в состав природных мембран и обеспечивающие их высокое электрическое сопротивление). Полученные комплексы оказались эффективными генераторами мембранного потенциала за счет энергии переноса электронов в расщепления АТФ. Более того, эти два ферментативных комплекса оказалось возможным разместить в одной и той же искусственной мембране.
Теперь следовало ожидать, что энергия мембранного потенциала, генерируемого при переносе электронов в реконструированной системе, должна при участии АТФ-азы, локализованной в той же мембране, накапливаться в АТФ. Ожидаемый результат был получен в изящных опытах американского ученого Рэкера. Тем самым была достигнута реконструкция в пробирке природного акта трансформации энергии из достаточно простых, в значительной степени изученных и доступных дальнейшему исследованию компонентов митохондриальной мембраны. Интенсивные эмпирические поиски этого решения начаты были давно и продолжались в лаборатории Рэкера, а также в ряде других исследовательских коллективов почти двадцать лет. В итоге стало очевидным, что ошибочные теоретические предпосылки относительно механизма взаимосвязи реакций переноса электронов и выработки АТФ (то есть схемы химического сопряжения) задержали решение столь важнейшей проблемы по крайней мере на пять-шесть лет (вспомним, что книга Митчела появилась в 1966 г., а первая публикация в 1961 г.).
Доказательство схемы Митчела фактически означает не только установление конкретного биохимического механизма, но, и нечто большее. Как пишет В. П. Скулачев, «предположение Митчела состоит в том, что энергия дыхания, превращенная из химической формы в электрическую и осмотическую, может быть затем вновь возвращена в химическую форму при синтезе АТФ или обратном переносе электронов. Известные до последнего времени биологические процессы превращения химической энергии в другие ее формы считались необратимыми. По существу, Митчел постулирует новый принцип биоэнергетики, утверждающий возможность обратимых превращений различных форм энергии в биологической системе»
Успехи в понимании механизма энергетического сопряжения еще не означают, что проблемы биоэнергетики полностью решены. Самая главная проблема, которая остается без ответа, - это молекулярные основы механизма фосфорилирования. Каким образом осуществляется передача электрона от одного переносчика к другому? Как создается мембранный потенциал? Каким образом ферментная система АТФ-аза преобразует энергию электрического поля и концентрационного градиента ионов водорода в энергию АТФ?
Окончательное доказательство схемы Митчела во многом зависит от установления степени универсальности тех принципов, которые обнаружены для биоэнергетических механизмов. Вопросы здесь начинаются уже с самого принципа энергетического сопряжения. Известно, что в дыхательной цепи митохондрий имеется три пункта фосфорилирования. Хемиосмотический принцип Митчела наиболее доказан лишь для третьего пункта. Остается также недостаточно изученным фосфорилирование в хлоропластах и бактериях. А процессы аккумуляции энергии для фотосинтеза? Мы знаем фермент пирофосфатсинтетазу, которая, по крайней мере у фотосинтезирующих бактерий, запасает в молекулах пирофосфата энергию, освобождающуюся при переносе электронов. И. С. Кулаевым с сотрудниками обнаружено, что пирофосфат-синтетаза имеется также у митохондрий наряду с АТФ-синтетазой. Если эти данные подтвердятся и для хлоропластов, то монополия АТФ как единственного универсального микроаккумулятора энергии будет частично ограничена.
Еще один биоэнергетический механизм, до последнего времени казавшийся абсолютно универсальным, по последним сведениям, может иметь альтернативу. Появились сообщения, что стандартная схема фотосинтетического образования АТФ с участием хлорофилла и цепи переноса электронов «отвергнута» бактериями соляных озер. Эти бактерии, вероятно, ведут синтез АТФ с помощью родопсиноподобного белка (родопсин - окрашенный белок, занимающий ключевую позицию в механизме зрения млекопитающих), который трансформирует энергию света в мембранный потенциал без посредства цепи переноса электронов. Будущие исследования должны подтвердить или опровергнуть эту сенсационную новость. Во всяком случае, мы видим, что представления исследователей о процессах энергообеспечения жизненных процессов все более углубляются и дают в наши руки действенное орудие управления ими.
