В ожидании нового метода
Работу любой системы удобно изучать, поочередно выключая отдельные её части. Таким способом можно выявить те из них, что важны для работы всей системы. Определив ключевые элементы системы, полезно научиться ими манипулировать, тогда мы сможем управлять процессом по своему усмотрению и изучать его в деталях. Однако когда речь идёт об исследовании нервной системы, применение такого подхода сталкивается с серьёзными трудностями.
В мозге человека находится около 80 миллиардов нейронов, образующих сложные разветвлённые сети. Считается, что каждая отдельная нейронная сеть может определять некую элементарную функцию. Взаимодействие этих сетей в разных зонах мозга обеспечивает сложную нервную деятельность. Долгие годы о функциях структур мозга судили по нарушениям, которые появлялись при повреждении его участков, или по тому, какие зоны мозга активны при выполнении испытуемым различных заданий.
Интересные результаты были получены в экспериментах на животных, в мозг которых вживляли электроды, чтобы искусственно возбуждать те или иные участки мозга. На животных проводили и исследования с использованием химических веществ, способных избирательно тормозить работу нейронов определённого типа. Однако каждый из этих методов имеет существенные недостатки: либо действие одновременно на большое количество нейронов, либо низкое временн?е разрешение. Даже самый малый вживлённый в мозг электрод неизбирательно возбуждает все окружающие его нервные клетки, а самый современный химический ингибитор действует гораздо дольше, чем естественные стимулы.
Инструментарий
Идею управлять нейронами «точечно» впервые чётко высказал в 1979 году Френсис Крик (получивший Нобелевскую премию за открытие структуры ДНК). Спустя двадцать лет, в 1999-м, он предложил использовать для возбуждения нейронов свет. Световое излучение имеет много преимуществ: оно быстро достигает объекта, его легко дозировать и представлять в виде коротких импульсов. В 2005 году группа исследователей из Стэнфордского университета под руководством Карла Диссерота сумела вызвать возбуждение нервных клеток, облучая их светом. Для этого нейроны пришлось подвергнуть генно-инженерным манипуляциям. Новый метод получил название оптогенетики и за последние годы произвёл настоящую революцию в исследованиях нервной системы.
Чтобы нейрон стал светочувствительным, он должен иметь белок — рецептор света. Пример нейронов, чувствительных к свету «от природы», — клетки сетчатки глаза. Они содержат рецептор родопсин, который состоит из белка, называемого опсином, и кофактора ретиналя — производного витамина А. Под действием света ретиналь меняет свою структуру, и эти изменения передаются на белок, который активирует сигнальные пути нейрона, вызывающие его возбуждение. В покое нейрон заряжен отрицательно: внутри клетки концентрация натрия и прочих положительных ионов мала. При возбуждении включаются ионные каналы в наружной мембране нейрона, закачивающие положительный натрий внутрь. Заряд внутри клетки становится положительным. В таком состоянии нейрон возбуждён и готов передать сигнал остальным нейронам в сети.
Первые попытки создать нейроны, управляемые светом, заключались в переносе в них опсиновых генов млекопитающих. Чтение нового гена в таких нейронах приводит к синтезу светочувствительного белка. Эти работы, проводившиеся в начале 2000-х, имели очень ограниченный успех. Под действием света искусственные нейроны с родопсином активировались медленно и нестабильно. Сигнальные системы нейронов не предназначены для взаимодействия с родопсином. Казалось, оптогенетика, едва возникнув, зашла в тупик. Решение пришло неожиданно.
Не только животным нужно чувствовать свет. Светочувствительными рецепторами обладают, например, одноклеточные водоросли. Их «зрение» также основано на работе родопсинов. Замечательное свойство этих белков заключается в том, что они не только воспринимают свет, но и сами играют роль ионных каналов и вызывают возбуждение клетки. Поэтому их принято называть канальными родопсинами. Оказалось, что эти белки работают гораздо стабильнее родопсинов млекопитающих. Нейроны, несущие их на своей поверхности, дают быстрый и чёткий ответ на световое излучение. Первый канальный родопсин открыли американцы Д. Остерхельт и В. Стокениус в 1971 году, но прошло более 30 лет, прежде чем родопсины микроорганизмов и нейроны млекопитающих «встретились». В ходе исследований родопсинов микробов открыли целый ряд светочувствительных белков с разными свойствами. Одни из них проводят ионы натрия, другие — сразу несколько типов положительных ионов. Есть родопсины, напротив, выводящие положительные ионы из клеток. Они способны снимать возбуждение. Таким образом, можно не только целенаправленно активировать, но и выключать нейроны. Особого внимания заслуживают родопсины, воспринимающие свет с разной длиной волны. Это позволяет одновременно и независимо управлять разными группами нейронов с помощью, например, синего и красного света.
В 2002 году биологи из Франкфурта описали новый родопсин одноклеточной зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Этот белок стал первым канальным родопсином, использованным для управления нейронами. Сначала обнадёживающие результаты были получены на культурах клеток. Следующий шаг — управление нейронами в мозге живого организма — стал возможен благодаря развитию генно-инженерных методов. В 2005 году, вскоре после экспериментов с культурами клеток, группа под руководством Хирому Яво из Университета Тохоку в Японии провела эксперимент с мозгом живой мыши.
Существуют два способа доставить ген родопсина в клетки мозга. Первый предполагает получение трансгенного организма. Так, например, ген родопсина может быть встроен в геном мыши на стадии эмбрионального развития, и тогда все клетки тела будут его содержать. Но работать этот ген станет не во всех клетках, а лишь там, где он будет активирован. Активностью гена можно управлять. Обычно для этого в последовательности ДНК перед геном размещают «управляющий» участок. Чтобы ген активировался, этот участок должен быть прочитан белками клетки. Существуют последовательности, которые могут быть прочитаны только в клетках определённого типа. Современной генетике известны сотни таких сигналов для разных клеток и тканей, в том числе и для разных типов нейронов. Есть ряд замечательных модификаций этого подхода, позволяющих использовать библиотеки трансгенных животных (созданные в других исследованиях) для нацеливания родопсинов в разные клетки нервной системы. Однако получение трансгенной мыши требует нескольких месяцев.
Второй способ доставки гена в клетки работает гораздо быстрее. В нём используются вирусы, несущие ген родопсина. В случае введения в мозг достаточно большого количества вируса, проникающего в нейроны, наработка светочувствительных белков происходит очень эффективно. Генно-инженерные вирусы, используемые для этих целей, сильно изменены и не способны размножаться. Они эффективно проникают в клетки и нарабатывают в них родопсин, в остальном для организма экспериментального животного они безвредны.
Отдельная задача — доставка света к нейронам, расположенным в глубине мозга. В большинстве случаев для этого используются оптоволоконные световоды. Источником света может служить лазер или светодиод. Конструкция устройств позволяет грызуну свободно перемещаться в клетке, несмотря на постоянно подключённый к голове кабель. С недавней разработкой родопсина, активируемого красным светом, задача освещения мозга упростилась. Красный свет хорошо проникает в ткани и в ряде задач при его использовании удастся отойти от внедрения в мозг оптоволокна.
Искусственные воспоминания
Благодаря оптогенетике множество вопросов, касающихся работы мозга, получили шанс на решение. Так, например, высокоточная прицельная активация или высокоточное прицельное выключение зон мозга позволили картировать области, ответственные за долговременную и кратковременную память. Кроме того, появилась возможность подойти к изучению памяти с новой стороны.
Наше восприятие окружающего представлено в мозге сочетанием активных и бездействующих нейронов. Воспоминание — это воспроизведение той комбинации возбуждённых нейронов, которая когда-то возникла. В одной из недавних работ, выполненных в Массачусетском технологическом институте под руководством нобелевского лауреата Судзуми Тонегавы, у мышей при помощи света вызывали воспоминания и придавали им новый смысл. Это исследование основано на классическом подходе к изучению памяти с использованием мыши в качестве модельного объекта. В центре внимания находится реакция страха на электрический шок, возникающая в комнате, где животное когда-то его испытывало.
Представим себе мышь в комнате А, здесь она ведёт себя обычно. Перенесём грызуна в комнату Б с другим окружением и подвергнем слабому электрическому шоку. Теперь при каждом переносе в комнату Б мышь будет испытывать страх даже без шока. Оценить страх в данном случае достаточно просто: обычно очень подвижный грызун группируется и замирает. Воспоминание о комнате Б ассоциируется у животного с болевым ощущением. Нейробиологам удалось сделать светочувствительными только те нейроны, которые активировались во время нахождения мыши в комнате А. Комбинация светочувствительных нейронов в данном случае — записанное воспоминание об этой комнате. Далее экспериментаторы вызывали это воспоминание с помощью света во время электрического шока в комнате Б. Стала ли мышь после этого бояться удара в комнате А, где никогда раньше его не испытывала? Правильный ответ: да.
Красота этой работы основана на более ранних исследованиях мозга, выявивших в нём участок, связанный с воспоминаниями. Это гиппокамп. Именно с его нейронами производились манипуляции в упомянутом эксперименте.
Возвращение к сетчатке
Итак, родопсины микробов признали удачным инструментом для создания светочувствительных клеток. Но можно ли микробные родопсины применить для лечения слепоты? Существует наследственное заболевание — пигментный ретинит, связанное с дегенерацией клеток сетчатки глаза. Оно вызывает прогрессирующую потерю зрения. Эффективного лечения для пигментного ретинита сегодня не существует. Значительная часть случаев этой болезни связана с нарушениями в гене, кодирующем родопсин. Этот ген важен для работы двух типов клеток-рецепторов в составе сетчатки. Это палочки, обладающие хорошей светочувствительностью, но не способные обеспечивать цветное зрение, и колбочки, позволяющие различать цвет, но менее чувствительные к интенсивности света. У больных пигментным ретинитом клетки палочки достаточно быстро гибнут, однако колбочки, потеряв способность воспринимать свет, живут ещё долгое время. Есть ли возможность заменить в оставшихся клетках неработающий родопсин на светочувствительный белок из бактерий? Группа исследователей из Швейцарии под руководством Ботонда Роска для ответа на этот вопрос использовала канальный родопсин архебактерий.
Существует мышиная модель пигментного ретинита. Если с помощью вирусов внести микробный родопсин в колбочки сетчатки, у грызунов наблюдается частичное восстановление зрения. В стандартных тестах такие мыши демонстрировали улучшение ориентации в пространстве в сравнении с больными грызунами без терапии. Интересно, что использованный в работе микробный белок, называемый eNpHR 3.0 (усовершенствованный галородопсин из Natronomonas pharaonis версии 3.0), — уже третья версия модифицированной исходной молекулы. Методами генетической инженерии постоянно ведётся усовершенствование микробных родопсинов для улучшения их работы в клетках млекопитающих.
Перенос такого метода лечения на человека — непростой шаг, поскольку в нём используются вирусы. Требуется много дополнительных контрольных экспериментов, чтобы показать полную безвредность этой технологии для людей. Тем не менее авторы показали эффективность работы белка eNpHR 3.0 в изолированных клетках сетчатки глаза человека. Подобные работы — серьёзное продвижение к терапии болезней, связанных с потерей активности нейронов. Например, если клетки, пострадавшие при нейродегенеративном заболевании, сделать светочувствительными, их работу можно вновь запустить, облучая светом.
Не только нейроны
Возможность управлять почти любыми группами нейронов в мозге породила новые экспериментальные работы, многие из которых стали настоящим прорывом в своей области. Но сегодня приложение оптогенетики — это не только нейроны. Строго говоря, к оптогенетике можно отнести любой метод, предполагающий активацию какого-либо процесса светом, если возможность такой активации обеспечена методами генной инженерии.
На данный момент созданы системы, в которых свет может управлять активностью гена, выключать работу белков или запускать клеточную гибель. Примечательно, что в таких исследованиях используются не только белки, действующие как ионные каналы. Так, например, получен белок, названный KillerRed (красный киллер), вырабатывающий при облучении светом активные формы кислорода. Активный кислород способен разрушать любые органические молекулы. Облучение красным светом клетки с достаточно большим количеством белка KillerRed вызовет её гибель. Впрочем, подобный метод можно использовать не только для убийства целой клетки. С помощью генетических методов участок, генерирующий активные формы кислорода в небольших количествах, можно включить в любой клеточный белок. Тогда свет вызовет инактивацию всех таких белков в клетке, что позволит судить об их функции. Перспективной также может оказаться целенаправленная доставка светочувствительных молекул в клетки раковых опухолей для их уничтожения.
Идея управления клетками с помощью света родилась задолго до появления оптогенетики. Однако для её реализации требовалось развитие ряда областей науки, в особенности генной инженерии. Интересно наблюдать, как из несвязанных работ по изучению светочувствительных белков микробов и мозга млекопитающих возник метод, признанный научным сообществом революционным. Объединив несколько научных областей, оптогенетика сегодня сама стала двигателем технологий, разрабатываемых под её запросы.
