Изучение механизма роста кристаллов необходимо для решения множества практических задач. Особенно полезными в этом плане оказались кристаллы лизоцима - белка-фермента, который помогает организму защищаться от бактерий. Взглянуть на его кристаллическую решетку исследователям удалось с помощью новейшего метода - атомно-силовой микроскопии. Для того чтобы понять, как функционирует та или иная белковая молекула в живой клетке, в первую очередь нужно узнать ее пространственную конфигурацию. Как же "взглянуть" на устройство одной-единственной молекулы? Чтобы сделать это, необходимо строго упорядочить множество молекул в пространстве, то есть, другими словами, вырастить из белка кристалл.
Долгое время единственным методом изучения белковых кристаллов был рентгеноструктурный анализ. Суть его состоит в следующем: кристалл просвечивают под разными углами рентгеновскими лучами, а затем по картинам дифракции с помощью математических методов восстанавливают расположение отдельных атомов. Совсем недавно появилась и другая возможность исследования кристаллической структуры белка - метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). При ЯМР кристаллы подвергают воздействию постоянного магнитного поля, затем их облучают электромагнитным излучением в радиочастотном диапазоне. Прибор регистрирует излучение, которое испускают ядра, имеющие магнитные моменты. Для обоих этих методов важны размер и упорядоченность кристалла. Чем больше и совершеннее кристалл, тем полнее и точнее получаемые данные. Для создания полной картины структуры белковой молекулы в пространстве необходимо вырастить кристаллы размером более 0,1 мм. Получение их - дело очень трудное. Многие белки так и не удалось кристаллизовать до сих пор.
Но непосредственно увидеть, как молекулы белка упакованы на гранях кристалла, стало возможным только после изобретения атомно-силового микроскопа: игла, закрепленная на упругой микропластине, скользит по поверхности исследуемого образца; по величине изгиба микропластины, который регистрирует оптическая система, судят о высоте дефекта на поверхности. Кстати, с помощью такого микроскопа ученые могут не только в деталях рассмотреть одну большую молекулу, но и измерить ее длину и определить количество ответвлений у основной молекулярной цепочки. Атомно-силовая микроскопия позволила также взглянуть на периодическую атомную решетку на поверхности кремния, графита, слюды, различных полупроводников и металлов. Уникальные возможности атомно-силового микроскопа состоят в том, что можно наблюдать за состоянием поверхности образца не только на воздухе или в вакууме, но и в растворе. Применительно к растущему кристаллу это позволяет, снимая кадр за кадром через небольшие промежутки времени, проследить движение ступеней и изломов и даже измерить скорость роста.
Наблюдать структуру и дефекты решетки необходимо не только для того, чтобы узнать пространственную структуру молекулы, но также для изучения молекулярных механизмов роста кристаллов. Зная их, можно научиться выращивать кристаллы больших размеров и идеальной формы, которые нужны для решения различных прикладных задач, например для получения синтетических драгоценных камней. А в Ливерморской национальной лаборатории (США) ученые пытаются вырастить кристаллы дигидрофосфата калия размером почти один метр в поперечнике, применяемые для нелинейного преобразования лазерного света при создании установки управляемого термоядерного синтеза. (Также кристаллы дигидрофосфата калия сверхбольшого размера выращивают в Институте прикладной физики РАН, см. "Наука и жизнь" № 4, 2003 г. - Прим. ред.) Чтобы такая установка работала, требуется 190 кристаллов совершенной формы и сверхбольшого размера. Белковые же кристаллы находят свое применение в медицине. Так, при тяжелом недуге - сахарном диабете - поджелудочная железа неспособна самостоятельно производить белок инсулин в достаточных количествах. Больному нужно постоянно вводить в кровь небольшие дозы инсулина. Оказалось, что для этого лучше использовать препарат, содержащий кристаллы инсулина: растворение кристаллов происходит медленно, и действие кристаллического препарата оказывается более продолжительным, чем раствора инсулина.
Первым белком, для которого установили (методом рентгеноструктурного анализа) пространственное строение, или, как говорят биологи, третичную структуру, был фермент лизоцим. Он же неожиданным образом и пришел на помощь ученым при изучении механизма роста кристаллов. Поскольку законы роста у неорганических и органических кристаллов одни и те же, лучше выбирать такие кристаллы, "строительные блоки" которых имеют больший размер. Тогда в атомно-силовой микроскоп можно увидеть дефекты на поверхности кристалла, их ступени и изломы. У большинства неорганических кристаллов строительными кирпичиками служат отдельные атомы, размеры которых составляют доли нанометра. (Нанометр - это мера длины в микромире, 1 нм = 10-9 м.) Другое дело молекулы лизоцима - они почти в 10 раз больше. Поэтому лизоцим очень удобен для наблюдения роста кристаллов с помощью атомно-силового микроскопа.
Лизоцим - белок примечательный во многих отношениях. Это фермент, то есть биологический катализатор, благодаря которому в клетке происходят химические превращения. Лизоцим обнаружен практически во всех живых организмах. У позвоночных его можно найти в слезах, слюне, селезенке, легких, почках, лейкоцитах и других составляющих организма. А всем он нужен потому, что защищает организм от самых разных бактерий. Лизоцим разрушает (лизирует) клеточную стенку бактерий и микробов, тем самым уничтожая их. Благодаря перечисленным выше свойствам лизоцим используют в медицине как противомикробное средство, в том числе в качестве добавки в продукты детского питания. Большое количество лизоцима входит в состав куриного белка. И что особенно важно для химиков, структура лизоцима полностью расшифрована и точно известно, как расположены в пространстве его атомы.
Молекула лизоцима состоит из повторяющихся звеньев - аминокислотных остатков, которые служат строительными единицами всех белков. Аминокислоты лизоцима, чередуясь, образуют длинную цепь. Итак, лизоцим - полимер или, точнее, учитывая его биологическое происхождение, биополимер. Биологические свойства белковых молекул зависят не только от их аминокислотного состава, но и от того, как составляющие белок полимерные цепи расположены в пространстве. Оказывается, незначительный сдвиг в укладке этих цепей может радикально изменить биологическую активность белка. Для полноценного функционирования белка точность местоположения отдельных функциональных групп должна достигать сотых долей нанометра. Размер одной молекулы лизоцима, выделенного из яичного белка, составляет 2,5ґ3ґ4 нм3. Интересно, что сама молекула лизоцима имеет форму куриного яйца, только слегка сплющенного. Правда, по размеру она меньше яйца в десять миллионов раз.
На поверхности молекулы куриного лизоцима есть косая щель, в которой находится так называемый гидрофобный "карман". Слово "гидрофобный" означает "боящийся воды", что отражает свойства этой щели: в водных растворах молекула белка ориентируется таким образом, чтобы избежать контакта "кармана" с водой. Молекулы лизоцима самопроизвольно поворачиваются одна к другой гидрофобными участками благодаря значительным силам притяжения между ними. "Карман" - активный центр лизоцима. Именно в нем происходит катализ биохимических реакций. Гидрофобные силы притяжения компенсируются электростатическими силами отталкивания, поэтому в природе кристаллы лизоцима практически никогда не образуются. Однако можно подобрать концентрации солей так, чтобы нарушить это равновесие и добиться кристаллизации белка.
Кристаллы лизоцима вырастают из его насыщенного раствора только в строго определенных условиях: в узком температурном интервале и в присутствии поваренной соли. Кроме того, для успешного роста кристалла необходимо добавить некоторое количество соляной кислоты (НСl), чтобы поддержать оптимальную кислотность.
Кстати, с помощью атомно-силового микроскопа достаточно просто получить даже трехмерное изображение бактериальной клетки. Для этого свежевыращенные на питательной среде бактерии переносят в дистиллированную воду, а затем каплю полученного препарата помещают на поверхность слюды. Через 5-10 минут, когда вода испарится, можно рассмотреть приготовленный образец в атомно-силовой микроскоп и увидеть бактерию. С точки зрения химика, поверхность бактерии состоит всего из нескольких полимерных молекул. Расщепляя одну из них, а именно ту, которая обеспечивает жесткость каркаса клеточной стенки, лизоцим разрушает всю бактерию. Ученые говорят: "Лизоцим катализирует гидролиз (1,4)-гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозаминовыми остатками му копептида в клеточных стенках бактерий". В растворе разрушенная бактерия принимает округлую форму, превращаясь в сферопласт - клетку, почти полностью лишенную стенки. Этот процесс ученым также удалось увидеть в атомно-силовой микроскоп. Результаты такого исследования сотрудники нашей Объединенной группы атомно-силовой микроскопии химического и физического факультетов МГУ недавно представили на международной конференции в Гейдельберге (Германия).
См. в номере на ту же тему
