Прошло четыре года со времени крупнейшего открытия в молекулярной биологии последних лет, открытия фермента, получившего название обратной транскриптазы.
Коротко напомним суть дела. Вся генетическая информация, передающаяся по наследству, как известно, сосредоточена в ДНК. Иначе говоря, в ДНК хранятся сведения о структуре белков, а именно они и определяют весь комплекс свойств живых организмов. Каждому белку соответствует определенный участок ДНК - ген (их сотни тысяч в каждой ДНК).
Для того, чтобы клетка в нужный момент приступила к изготовлению тех или иных белков, нужно прочитать информацию, записанную в ДНК. Эту функцию выполняет РНК-посредник, так называемая матричная РНК (мРНК). Вдоль определенного участка ДНК (а точнее гена) ферменты выстраивают нить мРНК, то есть синтезируют, как на матрице, точную копию гена. Происходит так называемая транскрипция - переписывание заключенной в ДНК информации на РНК.
Следующий этап синтезированная нить мРНК отделяется от ДНК, и с помощью других ферментов перемещается к месту синтеза белка (синтез идет в рибосоме).
Весь этот процесс легко записывается формулой ДНК->РНК->БЕЛОК.
И вот четыре года назад был открыт фермент - его называют обратной транскриптазой, или, короче, ревертазой, - который в определенных условиях осуществляет обратный синтез (иначе - обратную транскрипцию). Значит, здесь матрицей служит РНК, на основе которой строится ДНК.
Надо сказать, что впервые мысль о возможности обратной транскрипции была высказана киевским генетиком С. М. Гершензоном еще в 1960 году для истолкования результатов его опытов по вирусному заболеванию тутового шелкопряда.
А спустя десять лет, в 1970 году, это явление предельно ясно обозначилось при изучении РНК-содержащих вирусов, притом таких, которые способны вызывать злокачественное перерождение клеток.
Чтобы читателю было понятно, о чем идет речь, придется сделать еще одно отступление. Что такое РНК-содержащие вирусы? Это своеобразное исключение из правил живой природы наследственная информация таких вирусов записана не в ДНК, как у остальных организмов, а в РНК. И вот этот РНК-содержащий вирус, попадая в клетку организма, умудряется, каким-то образом влиять на наследственный аппарат клетки, заставляя ее перестроить свою работу - отказаться от синтеза своих белков, а взамен синтезировать так называемые вирус-специфические белки. Если можно представить, как ДНК-содержащий вирус, попав в клетку, подчиняет ее своему влиянию, присоединяя свою ДНК к ДНК клетки, то оставалось совершенно неясным, как это осуществляет РНК-содержащий вирус. Потому, что никем еще не наблюдалось объединение РНК, и ДНК.
Как осуществляет РНК-содержащий вирус свое влияние на клетку? Этот вопрос, в частности, задавали онкологи, изучая вирусы, вызывающие злокачественный рост. Ведь очень часто вирус - виновник образования опухоли - в ней не обнаруживается. Но клетки тем не менее остаются раковыми, это в них закреплено наследственно. Вопрос оставался неясным до открытия обратного синтеза. Теперь же на него можно дать следующий ответ РНК-содержащий вирус, проникнув в клетку, с помощью ревертазы создает ДНК, которая-то, и объединяется с генетическим материалом клетки.
Мы не знаем ни одного другого отдельного факта в области исследований молекулярной биологии, который бы вызвал столь же большой интерес, затронул бы столь же важные проблемы и разработка которого принесла бы за короткий срок сравнимые по значимости результаты, как открытие ревертазы.
Остановлюсь на трех коренных биологических проблемах, вернее, на трех научных областях, как принципиального теоретического, так и важнейшего практического характера, к которым упомянутое открытие имеет самое непосредственное отношение.
Вот эти области так называемая «центральная догма» молекулярной биологии; проблема злокачественного роста; генная инженерия.
Возможность обратной транскрипции затрагивает «центральную догму», сформулированную Фрэнсисом Криком, одним из «отцов» двойной спирали ДНК. По Крику, незыблемое правило, центральная догма всей молекулярной биологии есть представление о том, что поток генетической информации всегда направлен строго однозначно от ДНК - этой материальной формы гена и хранителя наследственной информации - к синтезируемой на ДНК, как на матрице, рибонуклеиновой кислоте, РНК. А эта последняя, в свою очередь, служит матрицей для синтеза белка - конечного продукта деятельности гена.
Итак:
ДНК -> РНК -> БЕЛОК.
Открытие обратной транскрипции, как уже говорилось, внесло изменение в эту формулировку. Обнаружилось, что в некоторых случаях первый этап обратим и формула должна быть записана иначе:
ДНК -> РНК -> БЕЛОК.
Следует подчеркнуть, что второй этап всегда остается незыблемым, то есть из белка в нуклеиновые кислоты информация не переносится. Именно здесь самой химической природой процесса наложен действительно непреодолимый запрет. Это положение имеет принципиальное значение.
Когда был открыт фермент, катализировавший синтез ДНК по РНК, некоторым исследователям сгоряча показалось, что тем самым ниспровергается центральная догма молекулярной биологии.
Но первый взрыв страстей в связи с открытием обратной транскрипции несколько утих и стало ясно, что ни о, каком «ниспровержении» центральной догмы говорить нельзя.
Нуклеиновые кислоты, как источник информации, кодирующей структуру белков, принципиально равноценны, независимо от того, принадлежат ли они к ДНК-овому типу или РНК-овому типу. В самом деле, разные вирусы, как уже говорилось, имеют в качестве своего генетического материала, как ДНК, так и РНК.
При биосинтезе белков генетическая информация сначала обязательно «переписывается» на РНК, а уже затем переводится в аминокислотную последовательность синтезируемых белков (как вы помните, строительными блоками белков являются аминокислоты). Между молекулой ДНК, и синтезируемой по ней молекулой РНК имеется линейное соотношение 1 1 (одно звено - нуклеотид - в ДНК соответствует одному звену - нуклеотиду - в РНК). Напротив, при синтезе белков одной аминокислоте соответствуют три нуклеотида.
В мировой литературе не описано ни одного опыта, где бы по матрице белка, то есть по цепочке аминокислот, можно было бы получить нуклеиновую кислоту. Более того, есть весьма серьезные теоретические возражения против такой возможности. Поэтому, разумеется, с обнаружением обратной транскрипции ни о, каком ниспровержении центральной догмы говорить не приходится. Речь идет лишь об уточнении, о некотором дополнении первоначальной точки зрения, о большей гибкости формулировки и лишь в приложении к редким, особым случаям.
Процесс обратной транскрипции идет, как уже говорилось, под действием фермента обратной транскриптазы, или, как мы его короче обозначили, - ревертазы.
Итак, одна из особенностей ревертазы - внесение нового элемента в центральную догму молекулярной биологии, со всеми вытекающими отсюда следствиями.
Вторая проблема, связанная с открытием ревертазы, состоит в том, что способность к обратной транскрипции - иначе говоря, наличие ревертазы - была обнаружена впервые при изучении РНК-содержащих вирусов. А к числу таких вирусов принадлежат все известные к настоящему времени вирусы, способные вызывать злокачественное перерождение клеток (онкогенные вирусы). Ревертаза оказалась фактором, теснейшим образом, связанным с вирусно-генетической теорией происхождения злокачественного роста, выдвинутой впервые покойным Львом Александровичем Зильбером и сейчас практически общепринятой.
Третий из названных мною аспектов обратной транскрипции - генная инженерия. Эта новая линия исследования привлекает к себе чрезвычайно большое внимание. Под этим термином подразумевается возможность манипулировать генетическим материалом, с тем, чтобы получать определенные, заранее заданные сочетания наследственно закрепленных свойств.
Генная инженерия - будущее молекулярной биологии, магистральный путь ее выхода в практику. Само собой разумеется, что синтез ДНК посредством ревертазы - лишь один из элементов будущих систем генной инженерии, отнюдь не единственный, но, несомненно, очень важный.
Открытие обратной транскрипции, открытие ревертазы, поставило перед молекулярной биологией целый ряд проблем, разрешение которых требует сложных и тонких исследований. Простейший пример для того, чтобы только обнаружить ревертазу, нужно соблюсти несколько условий, каждое из которых совершенно обязательно - без него все изучение становится неосуществимым. Однако соблюсти все эти условия, то есть располагать всей совокупностью материалов, необходимых для эксперимента, или быть в состоянии самостоятельно изготовлять их, - совершенно недостижимо для обычной, отдельной лаборатории, которая захотела бы приступить к работе по ревертазе.
Такого рода исследования нуждаются и в специалистах самого разнообразного профиля. Только широко развитая промышленность тонкой препаративной и синтетической химии и развернутая кооперация ряда научных центров могут обеспечить успех дела. (Это, в частности, показали и работы американских ученых, достигших в данной области больших успехов.)
Было ясно, что для быстрого и оперативного продвижения к намеченной цели надо найти надлежащую организационную форму. Требовалось строго регламентированное, целенаправленное участие ряда научных организаций и лиц с четко фиксированными заданиями в каждом отдельном случае.
Так, было признано целесообразным придать этому начинанию форму специализированного проекта. И в октябре 1972 года отделение биохимии, биофизики и химии физиологических активных соединений Президиума АН СССР утвердило проект, названный «Ревертаза», и включивший в работу многие институты и лаборатории нашей страны и социалистических стран - проект к этому времени фактически уже начал свое существование.
Функции участников проекта были распределены в значительной мере в соответствии с основными звеньями, из которых складывалась работа по обратной транскрипции.
1. Для получения фермента ревертазы требуется большое количество высокоактивного вируса. Решение этой проблемы поручено Институту полиомиелита и вирусных энцефалитов в Москве (М. П. Чумаков, Н. А. Граевская), и Институту органической и биологической химии в Праге (И. Ржиман).
Препарата вируса, как правило, нужно много. В основном это вирус заболевания птиц. Важно, во-первых, иметь штамм вируса перврклассного качества, то есть достигающий высокой концентрации, около 10 11 частиц в миллилитре плазмы. Во-вторых, важно иметь хорошую линию кур, легко заражающихся этим вирусом (речь идет о том, получим ли мы нужное количество вируса, скажем, от 30 цыплят, или их потребуется три тысячи!).
2. За получение препарата ревертазы и разработку «тест-системы» взялись Институт молекулярной биологии АН СССР (Л. Л. Киселев, Л. Ю. Фролова), и Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (В. М. Кавсан и А. Рындич - под руководством Р. Бибилашвили в ИМБ).
Получение самого фермента - ревертазы - центральный пункт всей проблемы. И этот процесс представляет немалые трудности - в составе вирусной частицы всего около 5 молекул фермента, или около 1 процента от всего количества белка вируса.
«Тест-система» - это полный набор всех препаратов и реактивов, позволяющий проводить определение активности ревертазы. Подобного рода наборы (в английской терминологии «китт» - «Kit») для разных целей выпускаются зарубежными фирмами. Следует отметить, что мы сумели здесь опередить зарубежную промышленность - первые наши наборы ревертазного китт’а появились раньше и были более полными, чем те, что впоследствии стала выпускать одна из крупнейших фирм в США, «КАЛ-БИОХЕМ»
3. Получением синтетических матриц для «тест-системы» заняты Институт органической химии и Институт цитологии и генетики СО АН СССР в Новосибирске (Д. Г. Кнорре, Р. И. Салганик).
Речь идет о препарате РНК, служащей матрицей, на которой должна синтезироваться ДНК под действием ревертазы. Это может быть РНК самого вируса, но она так же ограниченно доступна, как и фермент ревертаза. Это может быть синтетическая матрица (она чаще всего используется для «тест-системы» или для ориентировочных опытов). Это, наконец, могут быть и природные РНК-полинуклеотиды, то есть индивидуальные мРНК, соответствующие различным индивидуальным генам.
4. Синтез олигонуклеотидов (так называемых «праймеров») налажен на кафедре химии природных соединений и в Межфа-культетной лаборатории биоорганической химии МГУ (М. Н. Прокофьев, 3. А. Шаба-рова).
«Праймер», или затравка, - это синтетически полученное вещество, необходимое для того, чтобы заставить ревертазу Действовать.
5. Меченный тритием тимидинтрифосфат высокой активности поставляют Центральный институт молекулярной биологии (профессор П. Ланген), и Институт исследования изотопов и источников излучений (профессор Г. Формум) в Берлине.
6. Немеченые дезокситрифосфаты идут из Новосибирска.
Сверх этого, в Институте органического синтеза в Риге (С. А. Гиллер) была начата работа по синтезу возможных ингибиторов ревертазы (веществ, тормозящих или прекращающих реакцию), которые могли бы обладать противоопухолевыми свойствами.
Все участники в высшей степени активно включились в работу и результаты очень быстро сказались.
Проект «Ревертаза» распадается на два четко разграниченных этапа. Первый этап - это создание «тест-системы», обеспечивающей возможность экспериментировать с ревертазой, заставляя ее вести обратную транскрипцию. Этот сугубо прагматический этап полностью завершен. Проект вступил во второй свой этап, когда созданная «тест-система» будет использована для развертывания исследований уже по тем или иным проблемам фундаментального, а также и прикладного, практического характера. Эти вопросы рассматривались на состоявшемся в марте прошлого года втором расширенном рабочем совещании участников проекта.
Но вот, что бы мне хотелось специально подчеркнуть. Центральная задача проекта, как уже говорилось, - это прежде всего изучение фермента, обусловливающего обратную транскрипцию, фермента ревертазы, что, кстати, отражено и в самом наименовании проекта. Однако, я полагаю, всем понятно, что владение методами получения и изучения фермента - это ни в коем случае не самоцель, не узкая задача, каких можно было бы надумать многие десятки, если не сотни для разнообразных ферментов. Дело в том, что фермент ревертаза - не, что иное, как инструмент, ключ для решения важных задач, как фундаментального, так и практического значения. Только ради этого и имело смысл затевать эту работу. По ходу дела оказалось, что значимость, сфера использования ревертазы необычайно расширились - от чисто вирусологических проблем до кардинальной важности общебиологических, таких, например, как искусственное конструирование генетических факторов. Едва ли приходится сомневаться, что время принесет еще немало сюрпризов этого же рода.
Для того, чтобы дать некоторое зримое представление о том, какое центральное место принадлежит ревертазе в молекулярно-биологических исследованиях сегодняшнего дня, я приведу таблицу и схему.
В таблице названы те лаборатории, в которых, судя по данным литературы, за последние годы была осуществлена транскрипция матричных РНК действием ревертазы.
На схеме показано, какие многочисленные и разнообразные линии исследования открываются в результате использования ревертазы в качестве мощного и многоликого орудия исследования.
По сути дела, многое, что отражено на этой схеме, должно стать предметом развертывания работ по проекту на его втором этапе, в который мы уже вступили.
Коллективная работа может организоваться по двум типам, в основе которых лежит в одном случае координация, в другом - кооперация.
Термин «координация» происходит от латинского слова «ординис» - порядок. В этом случае дело сводится к упорядочению исследований, выполняемых в различных научных учреждениях, с тем, чтобы избежать параллелизма, повторения или, наоборот, чтобы рекомендовать новые направления работ для заполнения обнаруживающихся пробелов. Тут от невыполнения темы, каким-либо из участников остальные не страдают, как не страдает и осуществление, какой-либо четко поставленной цели.
Иначе дело обстоит при кооперации (от латинского глагола «операре» - действовать). Предусматривается, что здесь каждый участник обязуется действовать в соответствии с твердо намеченными требованиями. Число и функции участников устанавливаются таким образом, чтобы совокупность всех их действий привела бы к достижению заданной цели. Поэтому, если выпадет одно звено из общего комплекса, то намеченная задача оказывается невыполненной. Такая форма организации накладывает на каждого из участников коллективной работы жесткие обязательства, каждый в одинаковой степени ответствен за выполнение работы в целом. Именно в этом и надо усматривать основное достоинство и преимущество организации работы в форме проекта.
На примере работы по проекту «Ревертаза» эти заключения в полной мере оправдались. Надо полагать, что именно такого рода организация коллективной работы вполне целесообразна не только в нашем, частном случае, а заслуживает того, чтобы ее рассматривать, как прототип, по образцу которого целесообразно вести работу и по ряду других проблем.
В этом же номере публикуется статья сотрудника Института молекулярной биологии АН СССР доктора биологических наук Л. КИСЕЛЕВА, рассказывающая об одной из конкретных работ, проведенной по проекту «Ревертаза»
