Фермент ревертаза, катализирующий синтез ДНК по матрице РНК, - новое мощное орудие исследования в молекулярной биологии. Путем обратной транскрипции получены информативные части генов ряда белков [об одной из таких работ рассказывает публикуемая статья. Синтез фрагментов генов вне клеток открывает новые перспективы в изучении биологии развития организмов и строения генетического аппарата клетки.
Частью исследований, проводимых в рамках проекта «Ревертаза», о котором подробно рассказано в статье академика Энгельгардта, был синтез молекул ДНК по матрице РНК. Эти работы выполнены кандидатом биологических наук Л. Ю. Фроловой и мной в лаборатории энзимологии белкового синтеза Института молекулярной биологии АН СССР (заведующий лабораторией - академик В. А. Энгельгардт) совместно с доктором биологических наук К. Г. Газаряном и его сотрудниками, работающими в Биологическом отделе Института атомной энергии имени И. В. Курчатова.
Первоначальная цель этих исследований состояла в том, чтобы научиться получать ДНКовые копии информационных (матричных) РНК (мРНК). Как известно, мРНК синтезируются с помощью специального фермента на участках ДНК. Эти участки ДНК - фрагменты генов, в которых закодирована структура различных клеточных белков, то есть последовательность строящих их аминокислот. Когда с помощью фермента осуществляется синтез мРНК по ДНК, мы получаем комплементарную (дополняющую) копию с ДНК. Если же с помощью другого фермента - ревертазы - получить ДНКовую копию теперь уже с мРНК, то в результате двойного копирования (ДНК->-мРНК -> кДНК) мы снова получим оригинал - участок ДНК.
Следовательно, синтезируя молекулы ДНК по матрице мРНК, мы, по существу, получаем с помощью фермента в пробирке, вне клеток, части генов. Эти части генов называются информативными, или структурными, поскольку в них записана информация о структуре соответствующего белка.
Итак, начальный этап работы заключался в том, чтобы получить с помощью ревертазы структурную часть гена. Для осуществления этого этапа нужно было иметь, как минимум фермент ревертазу и матрицу мРНК (подробнее о составных компонентах, необходимых в работе с ревертазой, рассказано в статье В. А. Энгельгардта).
Мы выделили ревертазу из вируса птичьего миэлобластоза, который был получен и очищен для нас профессором И. Ржи-маном, членом-корреспондентом Академии наук Чехословакии, одним из крупнейших специалистов в области биохимии опухолеродных вирусов. Позднее мы стали использовать в работе плазму больных цыплят, в которой содержится этот вирус, предоставленную нам доктором медицинских наук Н. А. Граевской (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР). Очистку фермента удалось осуществить весьма быстро, используя имевшийся у нас ранее большой опыт работы с другими ферментами и опираясь на методику, опубликованную к этому времени зарубежными исследователями.
Препарат мРНК был выделен из клеток (ретикулоцитов), специализированных в организме для производства глобина - белковой части гемоглобина, широко известного компонента крови, переносящего кислород из легких ко всем органам и придающего крови красный цвет. В отличие от американских исследователей, которые использовали клетки крови кролика и человека в качестве источника глобиновой мРНК, мы воспользовались ретикулоцитами голубя.
Проведя реакцию, важно, естественно, убедиться в том, что синтезирована действительно копия мРНК, которая служила матрицей. Для этого полученную в реакции ДНК, меченную радиоактивными изотопами, смешивали с глобиновой мРНК при повышенной температуре, а затем смесь охлаждали. В этот момент между ДНК, и мРНК образуется молекулярный гибрид, который можно анализировать двумя способами. Первый способ гибрид обрабатывают специальным ферментом (нуклеазой), который «съедает» ту ДНК, которая не вошла в состав гибрида.
Если ДНК не «съедается», значит, она точно скопирована с мРНК.
По второму способу продукты гибридизации анализируют в ультрацентрифуге. Известно, что плотность разных нуклеиновых кислот различна. Однотяжевая ДНК имеет наименьшую плотность, а РНК - наибольшую. ДНК - РНК гибрид занимает промежуточное положение. В центрифуге молекулы, имеющие разную «плавучую» плотность, займут соответствующие места в пробирке. С помощью этого метода анализа выяснилось, что продукт синтеза, как и следовало ожидать, имеет плотность, соответствующую ДНК - РНК гибриду, а после разрушения РНК - плотность однотяжевой ДНК.
Итак, оба метода дали согласованные результаты, показав, что практически вся синтезированная ДНК - это комплементарная копия мРНК, которая служила в синтезе матрицей.
В ходе опытов по молекулярной гибридизации между синтезированной ДНК, и глобиновой мРНК обнаружилось интересное обстоятельство. Эта реакция идет обычно очень медленно и при повышенной температуре, что известно из многочисленных опытов по гибридизации природных ДНК, и РНК. В описываемых же опытах реакция шла даже при комнатной температуре и за считанные минуты. Это аномальное поведение нуждалось в специальном объяснении, тем более, что в одной из зарубежных работ заметили аналогичное явление, но не сумели дать ему разумного истолкования.
Оказалось, что быстрая реакция связана с тем, что на одном из концов синтезированной нити ДНК содержится политимидиловая кислота.
Но откуда в молекуле ДНК появляется политимидиловая кислота?
Это легко уяснить, если вспомнить, что часть полиадениловой кислоты мРНК переписывается в политимидиловую кислоту при ферментативном синтезе ДНК.
В результате полученная ДНК состоит, как бы из двух частей - монотонной (скопированной с монотонной части мРНК), и собственно генной (скопированной с информативной части мРНК). Природа ускорения гибридизации за счет такой двойной структуры в каждой из молекул ДНК и мРНК хорошо поясняется таким сравнением. Представим себе, что надо застегнуть застежку «молнию». Каждому из повседневного опыта известно, что если часть «молнии» уже застегнута, то дальше половины соединяются одним легким движением руки. Напротив, если концы «молнии» не закреплены, то процедура займет гораздо больше времени. Вот наличие на конце, гибрида комплекса полиадениловой и политимидиловой кислоты играет роль такого «фиксатора», так, что слипание нитей идет значительно быстрее.
Чтобы устранить эту аномалию, достаточно добавить полиуридиловую или попи-адениловую кислоты. В этом случае поли адениловая кислота в мРНК или политимидиловая кислота в ДНК окажутся блокированными, закрытыми и выведенными из гибридизации. Опыт подтвердил, что в этом случае образование гибрида ДНК - РНК протекает с ожидаемой скоростью, а не слишком быстро.
Обнаруженное явление имеет существенное значение. Дело в том, что в молекулярной биологии ДНК, синтезированные путем обратной транскрипции, широко используются в опытах молекулярной гибридизации, где по скорости этого процесса судят, например, о количестве генов в геноме клетки. Не зная об аномалии в скорости гибридизации, и о том, как ее устранить, можно прийти к ошибочным заключениям.
При внимательном изучении свойств синтезированной ДНК было сделано еще одно наблюдение. Оказалось, что эти молекулы не представляют собой цепей, лишенных упорядоченных внутренних связей между мономерными звеньями, а имеют так называемую вторичную структуру. Вторичная структура у одиночной нити ДНК выражается в том, что основания одного участка молекулы вступают в водородные связи с основаниями другого, образуя «шпильку» «Шпильки» и создают определенную вторичную структуру этого участка гена. Мы не знаем биологической роли этой обнаруженной вторичной структуры, но возможно, что она имеет значение для строения хромосом и их функционирования.
СИНТЕЗИРОВАННЫЕ В ПРОБИРКЕ ДНК - ОРУДИЯ
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Синтез ДНК путем обратной транскрипции открывает новые, ранее не существовавшие возможности для молекулярно-биологических исследований. Приведу лишь несколько примеров, иллюстрирующих пути использования синтезированной ДНК, комплементарной мРНК (или сокращенно кДНК) для решения сложных проблем, волнующих исследователей.
Один из кардинальных вопросов, стоящих перед биологией, - вопрос о временном коде живых клеток, то есть вопрос о том, как реализуется во времени генетическая информация, записанная в ДНК.
Известно извлечение информации из ДНК происходит в два этапа - сначала происходит переписывание (транскрипция) ДНК в форму РНКовых последовательностей, с которых затем идет перевод (трансляция) в аминокислотную последовательность белков (ДНК -> РНК -> белок). Существенно важно знать, сопряжены или раздвинуты во времени эти два этапа у многоклеточных организмов - транскрипция и трансляция.
Синтезированная в пробирке ДНК - слепок с мРНК - отвечает на этот вопрос следующим образом. Из клеток, находящихся на разных стадиях развития, выделяют РНК, и смешивают с полученной путем обратной транскрипции кДНК, комплементарной к интересующей нас мРНК. Затем проводят так называемый «отжиг», то есть создают условия, при которых ДНК и РНК могут образовать молекулярный гибрид (о котором я уже упоминал). Если такой гибрид образуется, это означает, что в смеси разных молекул РНК, выделенной на данной стадии развития, уже присутствуют те ее участки, которые кодируют синтез интересующего нас белка. Если же гибрида не обнаруживается, следовательно, данный участок генома еще не переписан в РНКовую форму. Что касается стадии трансляции, то ее прохождение легко обнаруживается по биосинтезу того же белка.
Таким образом, получая молекулярные гибриды между разными препаратами РНК, и кДНК, можно уловить тот момент в жизни клетки, когда ген «заработал», и сопоставить с моментом синтеза соответствующего белка. Следовательно, мы наблюдаем воочию развертывание генетической информации во времени, то есть, по существу, исследуем молекулярные основы развития. Этот подход был крайне затруднен, пока не были получены ферментативно участки генов.
Тот же принцип дает возможность установить число генов в одной клетке для интересующего нас белка, только в данном случае гибридизация идет уже не с РНК, как в только, что рассмотренном примере, а с клеточной ДНК.
Теперь известно, что число одинаковых генов в клетках сильно варьирует - от нескольких тысяч до единиц и поэтому интересно знать, сколько же генов данного белка содержится в разных клетках и на разных стадиях развития организма. Например, гены глобина интенсивно работают в клетках крови, но не работают в клетках печени. Сохраняются ли эти «неработающие» гены в клетках печени? Или такой вопрос не приводит ли активное функционирование глобина в кровяных клетках к тому, что количество генов глобина на одну клетку увеличивается?
Комплементарная ДНК, и здесь оказывает существенные услуги исследователям. Оказалось, что число генов глобина и в клетках печени, и в клетках крови практически одинаково, то есть резкое различие в функции не приводит к перераспределению числа генов, приходящихся на одну клетку. Таким образом, специализацию клеток, по крайней мере в этом конкретном случае, следует связывать не с генетическим, а с последующими уровнями регуляции.
На этом примере видно, что даже такой вопрос, как специализация клеток разных органов, на первый взгляд весьма далекий от обратной транскрипции, может быть плодотворно исследован с помощью изложенного подхода через ДНК - слепок мРНК.
Среди заболеваний, от которых страдает человечество, большое место занимают так называемые молекулярные болезни, к которым относится талассемия - болезнь крови. Она выражается в том, что одна из полипептидных цепей, входящих в состав белка гемоглобина, а либо Р цепь, - не синтезируется (поэтому различают, а и 0-талассемию).
Чем вызвано подавление синтеза одной из этих цепей? Пользуясь ДНК, комплементарной к мРНК, кодирующей, а, и 0 цепи глобина, удалось прямо показать, что а-талассемия связана с резко пониженным содержанием, а - мРНК в клетках, а 0-талассемия - с аналогичным явлением в отношении В - мРНК. Это значит, что синтез данных мРНК блокирован. Исходный дефект, приводящий к болезни, следует, невидимому, искать в первичной структуре участков ДНК, связанных с регуляцией генетической активности.
В отличие от бактерий у многоклеточных, как известно, в клетках содержится больше одной хромосомы. Возникает вопрос, как распределены гены между разными хромосомами. Одинаковые гены могут быть сосредоточены, как в одной из многих хромосом, так и распределены равномерно или неравномерно по нескольким. Имея в своем распоряжении радиоактивную ДНК (часть гена), можно провести опыты по молекулярной гибридизации прямо на препаратах хромосом и затем найти по радиоактивности те точки на хромосомах, где находятся интересующие нас гены. Следовательно, не только число генов данного типа в клетке, но и их расположение в хромосомах, распределение между хромосомами также поддаются анализу через посредство ДНК, полученных путем обратной транскрипции.
На протяжении всего изложения подчеркивалось, что синтез ДНК по матрице мРНК позволяет получить не целые гены, а их части, кодирующие структуру белков. Однако сама система обратной транскрипции в принципе вполне годится и для синтеза полных генов. Для этого в качестве матрицы следует использовать не мРНК, а РНК - полные слепки с соответствующих генов.
К сожалению, методы выделения таких РНК еще не очень совершенны, так же, как и методы очистки. Кроме того, неясно, какие затравки следует использовать в работе с этими гигантскими РНК-слепками с генов. Однако эти трудности носят временный, технический характер. Получение полных биосинтетических генов путем обратной транскрипции, бесспорно, одна из близких задач в этой области. И решение ее даст возможность перейти к изучению не только структурных, но, и регуляторных частей генов. Эти регуляторные участки еще не изучены, однако именно они имеют самое непосредственное отношение к проявлениям генетической активности клеток и другим трудным проблемам современной биологии.
СТРУКТУРА ГЕНОВ
Сказанного, по-видимому, достаточно, чтобы показать широкие перспективы использования продукта обратной транскрипции - ДНК - в опытах по молекулярной гибридизации с РНК, и ДНК. Однако перечисленным отнюдь не исчерпываются возможности применения кДНК в молекулярной биологии. Как уже многократно подчеркивалось, кДНК представляет собой часть гена, и, следовательно, изучая структуру этой ДНК, можно перейти к прямому, непосредственному определению структуры генов. До сих пор первичную структуру генов, по существу, не анализировали, если не считать расшифровки отдельных коротких последовательностей некоторых внутренних участках молекул ДНК и на ее концах.
Между тем то счастливое обстоятельство, что молекулы кДНК сравнительно коротки (их размеры по длине составляют 100 - 200 тысяч дальтон против сотен миллионов дальтон у молекулы нативных ДНК), позволяет ставить, как реальную экспериментальную задачу расшифровку последовательности нуклеотидов, слагающих полимерную цепь кДНК. Уже имеющихся к настоящему времени методов достаточно, чтобы последовательность в 400 - 800 нуклеотидов (таковы приблизительные размеры разных синтетических ДНК) могла быть расшифрована за сравнительно короткий срок.
Зачем нужно расшифровывать первичную структуру генов? Знание полного химического строения вещества наследственности - ДНК, знание первичной структуры генов, помимо очевидного общебиологического и философского значения, позволит прямо сопоставить последовательность аминокислот в молекулах белков с последовательностью нуклеотидов в структурных частях генов. Из такого сопоставления можно выяснить, какие кодоны (так называются тройки нуклеотидов, соответствующие одной аминокислоте при биосинтезе белков) из нескольких возможных для данной аминокислоты использованы генетической системой исследуемых клеток и в, каком соотношении.
Знание конкретного генетического кода для разных белков и для клеток разных организмов позволит получить представления об общих закономерностях кодирования, об эволюции кодовых систем, о путях регулирования генной активности. До сих пор наши суждения в этой области (несмотря на расшифровку самого генетического кода) больше похожи на остроумные догадки, чем на точное химическое знание.
Поскольку пространственная структура биополимеров задается, определяется первичной структурой, расшифровка последней будет означать в определенной мере и выяснение пространственной организации генов. В современных представлениях о структуре генома и структуре хромосом, как раз и не хватает точных сведений о трехмерной структуре генов, хотя, согласно некоторым гипотезам, эта структура существенным образом влияет на функционирование генома.
В истории изучения обратной транскрипции многое кажется удивительным и счастливым стечением обстоятельств. Фермент, содержащийся в вирусных частицах и предназначенный для размножения РНК своего вируса, оказался весьма неразборчивым в отношении матрицы и практически прочитывает любые РНК, если к ним может присоединиться затравка и их трехмерная структура не очень прочна. Эта неразборчивость поистине подарок природы, который позволил ученым стремительно и решительно освоить совершенно новую область исследования - синтез структурных частей генов по индивидуальным мРНК вне клетки.
Открытие это вызвало настоящую цепную реакцию, где раскрылся целый веер дальнейших путей исследования, результаты которых, конечно, не замедлят сказаться.
