Доктор биологических наук С. КОНЕВ (Минск).
ЧУТЬ-ЧУТЬ ИСТОРИИ
В широкой научной аудитории слово «репрессор» прозвучало впервые в 1961 году в Москве, на Международном биохимическом конгрессе, проходившем в здании Московского университета на Ленинских горах.
Именно здесь крупнейшие французские ученые Ф. Жакоб и Ж. Моно, ныне лауреаты Нобелевской премии, работающие в бурно развивающейся области молекулярной биологии, нарекли термином «репрессор» то неуловимое вещество, которое наделено по их смелой гипотезе чрезвычайными полномочиями. Репрессор, по их словам, способен управлять активностью важнейшего представителя биополимеров - дезоксирибонуклеиновой кислоты, или сокращенно ДНК.
В наши дни ни у кого не возникает сомнения в том, что именно ДНК хранит в себе все основные запасы наследственной информации клеток, и организмов, именно в ДНК запрограммировано управление синтезом всех многочисленных белков. Структура белков - последовательность расположения аминокислот - записана в виде последовательности расположения троек нуклеотидов на нитях ДНК, как на телеграфной ленте (всего в этом алфавите 4 «буквы» - четыре различных нуклеотида). Реализация этой закодированной записи происходит следующим образом. С ДНК снимается копия, на которой, как на матрице, синтезируется также закодированная молекула информационной рибонуклеиновой кислоты (и-РНК). Последняя выходит из ядра в цитоплазму клеток и соединяется с рибосомами - органоидами, на которых синтезируется белок. Здесь-то, и происходит расшифровка записи кода на ДНК, выражающегося в безошибочном синтезе определенных белков по матричному принципу. Так возникает цепочка ДНК - и-РНК - белок.
ЗАЧЕМ НУЖЕН РЕПРЕССОР
Одной из удивительных особенностей работы этой цепочки является то, что ДНК «знает», какие белки, какие ферменты нужны клетке в данный момент и в, каком количестве. Создается впечатление, что ДНК бдительно, и неусыпно следит за потребностями и состоянием клетки, за изменением химического состава окружающей среды, В качестве подобного «ока, и уха государева» и выступают, по мнению Жакоба, и Моно, особые вещества - репрессоры. Соединяясь с определенным участком нити ДНК - оператором, репрессор тем самым выключает соседние участки ДНК. Эти участки, программирующие синтез одного, какого-нибудь белка (или белков), называются структурными цистронами. Структурный цистрон (или ген) - это тот участок нити ДНК, на котором записана первичная структура (последовательность аминокислот) одного, какого-нибудь белка. Значит, репрессоры регулируют активность ДНК на стадии ДНК - и-РНК, определяя тем самым, каким структурным цистронам суждено работать, а, каким нет. Длинная нить ДНК может быть уподоблена поэтому гирлянде лампочек (цистронов), часть из которых горит, а часть погашена репрессорами.
Различных видов репрессоров в клетке очень много. Их, правда, несколько меньше, чем структурных цистронов или соответствующих им белков, так, как один репрессор может управлять сразу несколькими структурными цистронами, заведующими синтезом белков-смежников, занятых в клетке близким делом последовательными операциями по химическому превращению, какого-либо конкретного вещества. Достаточно длинный участок ДНК, включающий в себя оператора и несколько управляемых им с помощью репрессора структурных цистронов, получил название оперона. Выключить работу оперона может только свободный, не связанный с субстратом репрессор. Репрессор же, связанный с соответствующим веществом, химическими изменениями которого занимаются ферменты, синтезируемые с участием оперона, не может этого делать.
Представим себе, что в среде, в которой живет, и размножается микробная клетка, нет сахара галактозы. Тогда и ферменту, занятому расщеплением галактозы - галактозидазе,-тоже нечего делать. Действительно, «галактозидазный» репрессор, поплавав в цитоплазме, и не встретив на своем пути галактозы, беспрепятственно соединяется с галактозидазным оператором ДНК и выключает тем самым синтез ненужного сейчас клетке фермента.
Но вот во внешней среде появилось много галактозы, способной обеспечить клетку энергией, и химическим материалом для процессов жизнедеятельности - роста и размножения. Появилась жгучая потребность в галактозидазе. Теперь уже репрессоры постоянно сталкиваются с галактозой, и соединяются с ней, образуя комплекс репрессор - галактоза. Такой комплекс уже не выключает кнопку оператора, то есть не соединяется с ним. Оперон начинает работать.
Вскоре через знакомую нам цепочку ДНК - и-РНК - белок в клетке появляется столь необходимый в данных конкретных условиях фермент галактозидаза. Возникает авторегулируемая цепочка обратных связей вещество - репрессор - ДНК - фермент - вещество.
Подобные обратные связи способны безошибочно, и достаточно тонко поддерживать необходимую концентрацию нужных ферментов в клетке, чутко реагируя на любые изменения во внешней среде, и притирая клетку к новым условиям.
Предполагалось также, что репрессор - это белок, «изготовляемый» под руководством определенных участков ДНК.
КРУПИЦА РЕПРЕССОРА В ПРОБИРКЕ
Надо прямо сказать, что вплоть до самого последнего времени репрессора никто не видел. О его существовании догадывались лишь на основании косвенных улик, по результатам его действия. Некоторые биологические явления становились понятными, если допустить реальность репрессора. В 1967 - 1968 годах положение резко изменилось удалось наконец выделить из клетки, и изучить первые два репрессора. Они были выделены из самого популярного, и самого изученного молекулярной биологией объекта - кишечной палочки. Физиологи в знак своей глубокой признательности уже давно увековечили в камне память собаки, и лягушки. Следовало бы, когда-нибудь соорудить подобающий памятник, и этому не видимому невооруженным глазом микроорганизму, хотя бы только потому, что для выделения измеримых количеств репрессора ученые извели килограммы кишечной палочки.
И вот результат - крупица долгожданного репрессора.
Первый из выделенных назвали лак-репрессором. Это белок достаточно солидных размеров даже для царства белковых биополимеров. Его молекулярный вес - 150 000. Он имеет достаточно сложную внутреннюю архитектуру, структурную организацию, и состоит из нескольких «блоков», так называемых субъединиц, каждая из которых имеет молекулярный вес до 40 000. Про такие крупноблочные макромолекулы в которых определенным образом уложены в трехмерном пространстве и сцементированы друг с другом более мелкие белковые молекулы - субъединицы, - говорят, что они обладают четвертичной структурой. Следовательно, лак-репрессор - это белок, наделенный четвертичной структурой. По-видимому, в его состав входят также, и основания нуклеиновых кислот.
В результате кропотливых экспериментов удалось изучить целый ряд важнейших физических, и физико-химических свойств выделенного репрессора. Как, и большинство белков, репрессор поглощает ультрафиолетовый свет. Спектр поглощения имеет интенсивный максимум при 277 миллимикронах, что указывает на вхождение в его состав ароматических аминокислот - тирозина, и триптофана. Он обладает, и электрическим зарядом, передвигаясь в электрическом поле.
Характерно, что бактериальный репрессор, как, и другие чужеродные для организма белки, способен после введения в кровь животных вызывать образование специфических иммуноактивных белков - антител. Как любой другой белок, репрессор чувствителен к высокой температуре, - он теряет свою активность при нагревании до +50° С. Теряет свою активность репрессор, и при воздействии фермента проназы, рвущей пептидные связи, то есть «переваривающего» белок.
Репрессор имеет, как бы две головы, два активных геометрических узора на поверхности своей гигантской макромолекулы. Одна его голова бдительно следит за внешней средой, другая - за ДНК, за активностью генетического аппарата клетки. Вместе же обе делают чрезвычайной важности для клетки дело корректируют работу биосинтетического аппарата клетки в соответствии с требованиями внешней среды, с изменениями ее химического состава. Это непременное биологическое требование к репрессору нашло поистине блестящее подтверждение в экспериментах над выделенным репрессором в пробирке.
Прежде всего лак-репрессор действительно жадно соединялся с тем веществом внешней среды, за концентрацией которого он призван следить по долгу службы, - за сахаром галактозой.
Американские ученые В. Джильберт, и Б. Мюллер-Хилл наблюдали образование прочных комплексов между репрессором, и производными галактозы - изопропилтиогалактозидом. Еще более поразительна способность лак-репрессора мертвой хваткой впиваться в молекулу ДНК. Очевидно, именно в тот участок ДНК (оператор), за состоянием - активностью - которого репрессор должен внимательно следить. Сродство (иными словами, прочность, и интенсивность соединения) лак-репрессора к своей ДНК поразительно. По предварительным данным Джильберта, и Мюллера-Хилла, константа Михаэлиса для образования комплекса репрессор - ДНК оказалась чрезвычайно высокой - 10-н - 1012 (величина константы, обратно пропорциональная сродству молекул, прочности образующегося между ними комплекса). Другие авторы приводят более скромные значения константы - порядка 10~10. Тем не менее сродство репрессора к ДНК крайне велико, оно в сотни или даже тысячи раз больше, чем у большинства известных белков-ферментов по отношению к субстратам. Да это, и понятно. Репрессор имеет примерно такое же право на ошибку, как сапер. Может статься, что за ошибку репрессора клетке придется заплатить своей жизнью.
Поучителен, и тот простой, но гениальный в своей простоте способ, с помощью которого был отделен комплекс репрессор - ДНК от свободного репрессора.
С давних пор люди привыкли отделять муку от отрубей при помощи сита мелкая мука проскакивает через отверстия, крупные отруби остаются на поверхности. Сходным приемом воспользовались, и ученые, взяв только вместо обычного кухонного сита так называемое молекулярное сито, имеющее очень маленькие поры, соизмеримые с размерами молекул. Молекулы свободного репрессора легко проскальзывали через эти поры, а намного более крупные, и громоздкие частицы - комплексы репрессор - ДНК - застревали на них. Именно благодаря этому простому приему удалось разделить комплексы от свободных молекул, и доказать неуемное сродство репрессора к ДНК.
Относительно более скромны пока наши знания о втором репрессоре, выделенном из клетки, - репрессоре лямбда фага. Кстати сказать, он, и получен был не в столь чистом виде, как лак-репрессор. Известно, что это белок с молекулярным весом около 30 000. По всей видимости, простой белок, не имеющий в своем составе субъединиц. Он несет на себе отрицательные заряды (так называемый кислый белок, богатый карбоксильными группами). Вот, пожалуй, пока, и все.
ГОРИЗОНТЫ РЕПРЕССОЛОГИИ
Великий русский физиолог И. П. Павлов высказал, как-то глубокую мысль о том, что любая наука развивается скачками, следующими за методическими «прорывами» К счастью, методика выделения, и очистки репрессоров в шкале превеликих трудностей молекулярной биологии оказалась относительно «простой» Можно ожидать поэтому, что в самое ближайшее время число работ, посвященных репрессорам, будет возрастать лавинообразно, в геометрической прогрессии или даже еще быстрее. Будут детально изучены «старые», и выделены новые. Будут расшифрованы их первичная, вторичная, третичная, и четвертичная структуры. Их физические, и химические свойства. Будет установлено, с помощью, каких сил, и, как свершается безошибочное, и неистовое соединение репрессора с субстратом, и ДНК. Станет ясным, что делает репрессор с ДНК. Обе головки, и тело репрессора окажутся общипанными буквально по волоску. Ученые узнают, и то, как происходит периодическое «сдирание» репрессора с ДНК, которое совершенно необходимо для полноценного функционирования обратных связей внешняя среда - клетка, согласно схеме Жакоба, и Моно. Есть ли в клетке специальный фермент, снимающий, отдирающий репрессор? Или же ДНК, наподобие собаки, периодически встряхивается, сбрасывая с себя груз старых репрессоров? Или же, наконец, сам репрессор просто «стареет» на ДНК. Иными словами, изменяет свою структуру, и свойства со временем, а затем самопроизвольно от нее отваливается? Все это пока вопросы будущего.
Возможно, что, когда-нибудь мы будем свидетелями зарождения новой отрасли молекулярной биологии - репрессологии. Сказанное выше не оставляет сомнения в том, что теоретическое значение эффектов репрессии в понимании механизмов, и физико-химических основ процессов жизнедеятельности, и прежде всего процессов авторегуляции, поистине трудно переоценить. Тем не менее Гёте был бесконечно прав, когда говорил, что истина-только та истина, которая для людей.
Могут ли люди ожидать практической пользы от репрессологии?
Достаточно близорукие глаза современника очень часто просто не в состоянии видеть ту огромную практическую пользу, которую не может не нести людям каждое по-настоящему крупное теоретическое завоевание. Достаточно, например, вспомнить в этой связи патриарха ядерной энергетики Э. Резерфорда, который даже на закате своей жизни, в преддверии второй мировой войны, отрицал возможность практического применения работ в области ядерной физики. Видел бы Резерфорд, как развитие науки уже в ближайшее десятилетие самым безжалостным образом опрокинуло его прогнозы!
Но вернемся к репрессологии, и попробуем все-таки, как-то пофантазировать о ее практических перспективах в столь иллюзорно обозримом будущем.
Прежде всего с помощью репрессоров, и эффектов репрессии можно планомерно, и сознательно управлять активностью ДНК, этого штаба клетки. Горизонты репрессологии в этом отношении достаточно широки. Укажем в этой связи лишь на некоторые ее перспективы.
Адаптация клетки к новым внешним условиям, например, питанию, может быть безболезненно облегчена снятием репрессии с тех генов ДНК, которые заведуют биосинтезом нужных ферментов в новых необычных условиях. Жизнь окажется подготовленной, встретит во всеоружии, и победит эти обычно неблагоприятные условия. Можно будет даже заставить клетку в изобилии синтезировать нужные человеку белки и, наоборот, не создавать ненужные, вредные. Можно будет репрессировать, подавлять те гены (структурные цистроны), деятельность которых приводит к патологическим, болезненным результатам. Будет возможно эффективно лечить различные молекулярные заболевания в их, так сказать, зародыше, первооснове, и превращать рецессивные (неработающие) гены в доминантные (работающие), и наоборот. Можно будет, вероятно, активно вмешиваться в процессы морфогенеза, и эмбриогенеза, планомерно формировать нужные свойства, и качества микроорганизмов, растений, животных. Следует, правда, оговориться, что пока у животных четко не доказано существования механизмов, укладывающихся в схему Жакоба и Моно. Возможно, что это является лишь результатом неполноты наших знаний на сегодняшний день.
