Метаболическая регуляция, или как бактерии говорят друг с другом

Метабиотиками называют препараты нового поколения, которые помогают кишечной микрофлоре правильно выполнять свою работу. Они поддерживают полезных бактерий и изгоняют опасных и бесполезных чужаков – в этом смысле метабиотики похожи на пробиотики, только действуют намного эффективнее и притом никаких бактерий в себе не содержат. В чем же тогда их секрет?

Метаболиты внутри клеток

Тем, кто знаком с основами биологии, термин «метаболическая регуляция» интуитивно кажется вполне понятным: в живых клетках протекают биохимические реакции, в ходе которых образуются метаболиты – результат превращения одних веществ в другие. Метаболиты, в свою очередь, влияют на биохимические процессы, и не только на «свои» ферменты, но и на те, что заняты в других реакциях. Все это можно было бы назвать метаболической регуляцией, однако применительно к внутриклеточным процессам термин «метаболическая регуляция» малоконструктивен: внутри клеток большинство процессов так или иначе регулируются метаболитами, и нет смысла лишний раз это подчеркивать.

Академик С.С. Шварц, предложивший термин «метаболическая регуляция» в 70-е годы прошлого века, основывался на экспериментах с водными животными, и имел ввиду, конечно, не те метаболиты, которые остаются внутри клеток, а те, которые выделяются в окружающую среду и которые притом не являются феромонами или другими специализированными сигнальными молекулами. То есть, когда мы говорим о метаболической регуляции, то имеем в виду не внутриклеточные процессы, а то, что происходит на более высоком иерархическом уровне – процессы межклеточной коммуникации в тканях и органах, одноклеточных и многоклеточных организмов, животных и растений. Охватить столь обширный материал в сравнительно небольшой статье, безусловно, не удастся, так что мы постараемся более-менее подробно описать лишь микробиологический аспект метаболической регуляции.

Странно было бы лишний раз говорить о том, что популяция бактерий начинается с бактерий. Однако сколько должно быть «отцов-основателей» – один, два, десять? На самом деле, в большинстве случаев для того, чтобы популяция начала расти, недостаточно ни одной клетки, ни десяти, ни даже сотни.

Для обычной кишечной палочки (Escherichia coli), если ее выращивают в простой питательной среде, в которой есть только глюкоза и минеральные соли, плотность бактерий-«первопоселенцев» должна составлять, как правило, не менее 10⁴–10⁵ клеток в миллилитре – иначе рост не начнется, и культура очень скоро погибнет. Почему так происходит? Ведь если говорить о бактериях кишечной палочки, каждая из них способна сама синтезировать все необходимые для жизни вещества, были бы только глюкоза с солями – зачем же ей нужны соседи? И все же соседи необходимы, и это касается не только бактерий, но и других микроорганизмов, в том числе и дрожжей, с которых, собственно, и началась история метабиотиков и метаболической регуляции.

Студент Лёвенского университета

Впервые на особенности коллективного поведения дрожжей обратил внимание еще Луи Пастер. В работе «Мемуар о спиртовом брожении» он отмечал, что дрожжи не могут расти в чистой или сахарной воде, если их очень мало, однако начинают размножаться, если плотность засева увеличить. Эти результаты, однако, в то время остались без внимания, и систематическое изучение феномена началось только в 1901 году с экспериментов студента 3 курса Лёвенского университета Вильдье, работавшего под руководством профессора М. Иде.

Сам Вильдье, получив медицинское образование, научной работой больше не занимался и вскоре трагически погиб при ликвидации эпидемии скарлатины, и начатое исследование продолжил Иде. Как и Пастер, Иде и Вильдье обнаружили, что после засева клетки выделяют в среду определенные вещества, которые способствуют их росту и брожению, но притом не являются основными источниками азота или углерода. Комплекс этих веществ получил условное название «биос».

На бактериях аналогичные эксперименты примерно тогда же провел Отто Ран, который также пришел к выводу, что скорость их роста зависит от концентрации некоего термостабильного вещества, выделяемого в среду самими бактериями. Чем выше была концентрация клеток, тем быстрее оно накапливалось в среде после их засева и, следовательно, тем быстрее культура начинала расти. Вслед за Иде и Вильдье Ран назвал это вещество «биос». Вскоре похожие результаты получили и другие видные ученые того времени. Работы, инициированные экспериментами Вильдье, в конечном итоге привели к открытию витамина биотина (В7), названного так по созвучию с «биос». Это знаменательное открытие отодвинуло на задний план исходную проблему автостимуляции роста. Сразу после опытов Рана были предприняты попытки идентифицировать состав «биоса», однако все они оказались неудачными – интерес к проблеме автостимуляции роста практически пропал и вновь возобновился только в 50-х годах прошлого века...

Новая волна

Новые исследования на эту тему начались с наблюдения, не имеющего к ней непосредственного отношения. В 50–60-е годы прошлого века биологи случайно обнаружили, что при автоклавировании растворов глюкозы в фосфатном буфере, когда глюкоза разрушается под действием температуры, получаются вещества, стимулирующие рост бактерии Bacillus globigii. В дальнейшем выяснилось, что аналогичным образом на рост микроорганизмов влияют фильтраты их культуральных жидкостей (то есть той среды, в которой росли бактерии). Почти через десять лет группа российских исследователей независимо обнаружила эффект автостимуляции роста в экспериментах с бактериями клостридиями и эшерихиями. Однако, несмотря на большое количество проведенных опытов, природа действующих веществ осталась невыясненной. Последняя неудачная попытка идентификации веществ «биос» состоялась уже в нашем веке, в 2001 году в лаборатории известного британского биохимика Дугласа Келла.

Однако, даже если мы не знаем природу вещества и механизм его действия, то использовать его на практике это обычно не мешает. Так получилось и с работами Вильдье и Рана: результаты их экспериментов нашли применение на практике задолго до идентификации веществ «биос».

«Биос» в биотехнологии

Вот, например, вопрос: что делать биотехнологу или микробиологу, если нужные ему бактерии отказываются расти? Прежде всего, согласно результатам Вильдье и Рана, следует увеличить количество засеваемых клеток или засевать то же количество бактерий, но уменьшить объем культуральной среды. Чем больше окажется бактерий в единице объема, тем быстрее они насытят среду веществами «биос» и тем скорее приступят к росту.

Но есть другой способ – добавить в среду загадочный «биос» и выращивать бактерии, не заботясь о плотности их засева. Опыты Вильдье и Рана и некоторых их последователей показали, что в качестве источника «биоса» можно использовать старую «истощенную» среду, ту, которую раньше просто сливали в отходы. Добавки на основе культуральной жидкости, содержащие «биос», позволяют на 15–20% повысить выход биомассы бактерий в больших промышленных биореакторах (ферментерах), помогают сократить время культивирования, уменьшить расход питательных веществ, энергии и количество отходов. Казалось бы, немного, однако при промышленном производстве даже повышение выхода биомассы на 10 % при одновременном сокращении производственного цикла, а также потребностей в сырье и воде приносит ощутимую экономию.

Желудочно-кишечный тракт человека, по сути, представляет такой же биореактор, как и промышленный ферментер, но только более эффективный. Достаточно сказать, что плотность микроорганизмов в нем достигает фантастического значения – 10¹¹–10¹² клеток микроорганизмов на миллилитр содержимого, тогда как в промышленных реакторах их концентрация на 1–2 порядка ниже. Кроме того, кишечник представляет собой реактор проточного типа. Это означает, что на входе в него практически постоянно подаются питательные вещества, которые перерабатываются микроорганизмами, а продукты переработки поступают в организм хозяина. Эксперименты с проточными реакторами показали, что культура в них очень быстро изменяется, и через 2–3 недели культивирования в таком реакторе остаются только наиболее быстрорастущие клетки, а те, что размножаются помедленнее, из реактора просто вымываются. При этом неважно, живут ли в реакторе одинаковые или разные бактерии; в любом случае, из них остаются только самые «плодовитые» микроорганизмы. Происходит так называемая селекция на протоке, по сути подобная селекции, осуществляемой человеком для получения наиболее плодовитых животных или растений.

Мы все знаем о пробиотиках – бактериальных препаратах, которые со времен И.И. Мечникова используются в качестве лечебно-профилактических препаратов для нормализации (оптимизации) микрофлоры человека. Но в процессе приготовления и хранения пробиотиков их бактерии повреждаются и, кроме того, переходят из активного в пассивное (покоящееся) состояние. И потому эффект селекции на протоке, который имеет место в кишечнике, сильно ограничивает потенциал пробиотических бактерий – они просто не успевают задержаться в желудочно-кишечном тракте. Чтобы вновь перейти к активному размножению, восстановить свои физиологические функции, адаптироваться к условиям среды и, в конечном итоге, прижиться в кишечнике, им необходим некий толчок. Таким толчком как раз и может стать «биос».

Актофлор – активатор микрофлоры

Вот так благодаря открытиям начала ХХ века возникла идея метабиотика – препарата на основе комплекса «биос», который повышал бы активность микроорганизмов в пробиотических препаратах. Но не только в них. По современным данным, человеческий организм населяют от 1000 до 2000 различных видов микроорганизмов. Редкий научно-исследовательский институт может похвастаться такой коллекцией! Некоторые бактерии микробиоты кишечника активно размножаются в нем, а некоторые просто существуют, незаметно обустроившись в складках пристеночного пространства кишки. Весьма вероятно, что среди них немало и вполне полезных, но только проявить свой потенциал у них не получается из-за чрезмерного роста других бактерий. Чтобы противостоять размножившимся соседям, им не хватает особого сигнала, то есть все того же «биоса».

Для оптимизации состава микрофлоры «биос» можно было бы добавлять в пищу, но для этого надо решить две проблемы: где найти подходящий «биос» и как его получать в промышленных масштабах. Требования к препарату достаточно очевидны: высокая активность, минимальное содержание посторонних веществ, безопасность для человека и, наконец, рентабельность производства.

Мы в лаборатории микробиологии Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов в Санкт-Петербурге предположили, что для получения «биос», соответствующего всем необходимым условиям, как нельзя лучше отвечает штамм бактерий Escherichia coli М-17. Люди старшего поколения, возможно, еще помнят препарат колибактерин, выпускавшийся как раз на основе М-17. Сейчас он почти забыт, а ведь было время, когда колибактерин был единственным на территории СССР пробиотическим препаратом. Для многих малышей и даже для пожилых людей он стал спасительным препаратом, который, впрочем, во времена всеобщего дефицита достать было совсем не просто. (Кстати, штамм E.coli М-17 открыл российский и советский микробиолог Леопольд Генрихович Перетц (1891–1961), и он же в 1930 году уже успешно использовал этот штамм в медицинских целях.)

При обычных условиях роста культуральная жидкость E. coli М-17 содержит не так много активных веществ, как хотелось бы. В результате многочисленных экспериментов условия культивирования удалось изменить таким образом, чтобы активность культуральной жидкости увеличилась в десятки раз. Чтобы получить «биос», из нее удаляют бактерии и практически все высокомолекулярные вещества, потенциально опасные для человека. Полученный таким образом препарат не только эффективно стимулирует рост самого бактериального штамма, но и повышает его способность подавлять рост бактерий-«чужаков», как патогенных, так и просто тех, что не входят в состав микробиоценоза человека. Более того, оказалось, что «биос» E. coli М-17 активно стимулирует такие же свойства у других представителей нормальной микрофлоры, таких, как бифидобактерии и лактобациллы. Что же до «чужаков», то на них он в этом смысле почти не действует. Таким образом, в наших руках оказался препарат, избирательно стимулирующий рост бактерий нормальной микрофлоры человека. Его назвали «Активатором микрофлоры», впоследствии – Актофлор.

У читателя почти наверняка возникнет вопрос: «Почему Актофлор стимулирует рост только представителей нормальной микрофлоры? Как именно он узнает, где своя бактерия, а где чужая?» Ответы, как ни странно, значительно проще, чем могло бы показаться. Все дело в том, что E. coli – едва ли не первая бактерия, заселяющая кишечник новорожденного. В ее задачи входит обживание новой среды обитания и обеспечение всех необходимых условий для «приживления» других бактерий, и свой «биос» она вырабатывает именно для этого. Без кишечной палочки и ее «биоса» другие бактерии никак не смогли бы прижиться в кишечнике. С другой стороны, миллионы лет эволюции позволили нашим бактериям найти общий язык, и «биос» кишечной палочки – как раз результат долгой взаимной притирки разных микробов друг к другу.

Актофлор-С – синтетический аналог Актофлора

Можно ли создать искусственный аналог Актофлора, если мы узнаем, из чего он состоит? По предварительным оценкам, он содержит более ста соединений, из которых почти сорок удалось идентифицировать с использованием различных хроматографических и спектральных методов. Практически все они оказались хорошо известными и вполне доступными веществами, которые можно приобрести у фирм производителей реактивов, а потом смешать в нужной пропорции и получить некую модель культуральной жидкости бактерий. Что и было сделано. К великому удивлению, первый же эксперимент показал, что искусственно созданная смесь обладает практически той же биологической активностью, что и сама культуральная жидкость!

Но для полной уверенности нужно было сравнить несколько разных препаратов «натурального» Актофлора с их же искусственными аналогами. Если бы оказалось, что изменения в активностях у тех и других совпадают, то наличие однозначной связи между составом и активностью можно было бы считать доказанной.

Составлять композиции из сорока веществ – задача весьма трудоемкая и неблагодарная, поэтому, прежде чем проводить основные эксперименты, имело смысл убедиться в необходимости тех или иных соединений. Для этого изучали индивидуальную активность каждого соединения и их различных сочетаний, затем их по отдельности и группами исключали из искусственной смеси, сравнивая ее активность с активностью исходного препарата. В итоге количество необходимых компонентов уменьшилось всего до 16–18 веществ. В дальнейшем сравнение десяти «натуральных» (то есть полученных при культивировании бактерий) препаратов Актофлора с искусственными смесями показало, что между активностью и составом действительно есть четкая корреляция.

В принципе, разработку препарата на этом можно было бы и закончить. Однако возникла мысль обогнать природу – то есть путем подбора оптимальных соотношений концентраций компонентов получить еще более активный препарат. На поверку эта идея оказалась весьма плодотворной: активность в результате удалось повысить практически в десять раз. Конечный вариант содержал не сорок и не шестнадцать, а всего 12–13 основных соединений.

Таким образом, в результате проделанной работы был создан совершенно новый препарат, названный Актофлор-С (Актофлор синтетический), основанный на концепции бактериального «биос» и не имеющий аналогов в мире. Оставалось только испытать его в экспериментах на животных и в клинической практике, предварительно убедившись в его безопасности. Впрочем, сомнений по поводу безопасности не было, так как Актофлор, прототип Актофлор-С, на сей счет уже проверяли, и он оказался полностью безопасным.

В заключении Института токсикологии Министерства здравоохранения России относительно безопасности и фармакологической активности Актофлора-С говорится, что он малотоксичен, обладает большой широтой терапевтического действия и безопасен при длительном введении экспериментальным животным. При внутрижелудочном введении препарат не вызывает раздражающего эффекта и не провоцирует развития аллергических реакций, обладает иммуномодулирующим действием и не оказывает негативного влияния на репродуктивную функцию. У животных с дисбактериозом и язвой желудка препарат помогал быстро восстановить состав микрофлоры и приблизительно в два раза ускорял заживление язвенных поражения. Последнее показалось авторам исключительно важным, ведь это означало, что смесь бактериальных метаболитов положительно действует не только на микрофлору, но и непосредственно на организм хозяина. Дополнительные эксперименты с культурами тканей животных и человека показали, что Актофлор-С действительно стимулирует рост и размножение клеток иммунной ткани и кишечного эпителия.

При дальнейшем изучении выяснилось, что Актофлор-С обладает практически теми же свойствами, что и его прототип Актофлор, но при этом он намного эффективнее, то есть оказывает тот же эффект, но при существенно более низких концентрациях. Мало того, оказалось, что препараты бактериальных метаболитов при лечении могут использоваться подобно антибиотикам. В экспериментах с мышами, зараженными бактериями сальмонеллами, Актофлор-С сам по себе и вместе с пробиотиками повышал выживаемость животных. (Причем следует отметить, что сами по себе пробиотики, пусть и зарекомендовавшие себя как хорошие восстановители микрофлоры человека, от инфекции защищали слабо – мыши гибли во множестве.)

Эксперименты на животных позволили перейти к клиническим испытаниям. Еще до разработки Актофлор-С, его прототип, Актофлор, успешно применяли в Военно-медицинской академии для нормализации микрофлоры кишечника после использования антибактериальных препаратов. Сам Актофлор-С изучался в педиатрическом отделении ДГБ №1 Санкт-Петербурга. В исследовании участвовали пациенты от 11 до 18 лет, больные пневмонией. Все они получали антибактериальную терапию, из-за которой страдала нормальная микрофлора кишечника. При использовании же Актофлора-С у пациентов повышалась доля бифидобактерий, лактобактерий и типичной кишечной палочки, а вот «неправильные» штаммы кишечной палочки, наоборот, из кишечника уходили. Кроме того, у больных при приеме Актофлора-С повышался уровень иммуноглобулина А в слюне – то есть присутствие метабиотика в схеме лечения стимулировало и нормальную микрофлору, и иммунитет.

Поскольку в Актофлоре-С нет микробов, а есть только химические вещества, которые они выделяют, его можно принимать больным, у которых плохо работает иммунитет. С Актофлором-С нет опасности, что он создаст лишнюю нагрузку на ослабленную иммунную систему, тогда как с микробными пробиотиками есть риск, что их микробы проникнут во внутреннюю среду организма.

Что такое надежность?

Мы говорили о том, что Актофлор-С – многокомпонентный препарат. Если удалить из него какой-либо компонента, надежность его действия снизится. Что это значит? Все дело в том, что каждый компонент препарата действует не на всю популяцию бактерий сразу, а на какой-то ограниченный круг. Похожим образом обстоят дела и с другими медицинскими препаратами: при их испытании часто оказывается, что на кого-то они либо не оказывает должного действия, либо вообще вызывают противоположную реакцию. И, когда говорят о надежности препарата, то имеют в виду, что он действует, как надо, на большую группу людей.

Микробная популяция точно так же неоднородна по реакции на компоненты «биоса». Состав популяции микробов легко меняется в зависимости от условий их выращивания и ряда других факторов. В результате те вещества, которые максимально стимулировали рост всей популяции сегодня, завтра могут оказаться менее эффективными. Основное преимущество многокомпонентного препарата, такого как Актофлор-С, перед возможными аналогами с меньшим количеством ингредиентов как раз и заключается в том, что Актофлор-С стимулирует развитие пробиотических бактерий при самых разных условиях.

Интерес к метабиотикам как к препаратам нового поколения, постоянно растет, а это значит, что в ближайшем будущем мы узнаем о них много нового. Что до Актофлора-С, то его с прошлого года уже можно найти в аптеках Санкт-Петербурга и некоторых других городов.

Доктор биологических наук Тимур Вахитов, Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург.

На правах рекламы.