В 60-е годы молекулярно-биологическое направление получило в нашей стране прочную организационную основу - были созданы специальные институты и лаборатории. Нужно заметить, что молекулярно-биологические исследования нуждаются в специалистах, квалифицированных не только в биологии, но, и в физике, и химии в дорогой и сложной аппаратуре, в препаратах и реактивах, получение которых требует искусства и немалых затрат. Поэтому развитие исследований молекулярно-биологического плана потребовало от ученых немалых забот и усилий.
Сейчас можно назвать многие институты и лаборатории, ставшие признанными центрами молекулярной биологии и генетики. Это Институт молекулярной биологии АН СССР, Институт химии природных соединений АН СССР, Лаборатория биоорганической химии МГУ, Институт белка, Институт органической химии Сибирского отделения АН СССР, Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР, и др.
Советские ученые ведут исследования по многим направлениям молекулярной биологии. Разрабатываются и вопросы генной инженерии. В этой области сделаны только первые шаги. Но они приближают осуществление вековой мечты - создавать по собственному желанию сорта растений и породы животных, обладающие нужными человеку свойствами.
Практические приложения молекулярной биологии начинают вырисовываться все более отчетливо, хотя для их достижения потребуются еще немалые усилия. Один из разделов молекулярной биологии и генетики, который приблизился к рубежу практической реализации, - генная (генетическая) инженерия.
Конечная, но пока еще очень отдаленная цель генной инженерии - получение с помощью лабораторных приемов организмов - животных и растений - с новыми наследственными свойствами.
Чтобы трезво оценить реальные возможности генной инженерии, надо обратиться к природе явлений наследственности;
Свойства живого существа определяются особенностями обмена веществ, а он зависит от ферментов - биологических катализаторов, направляющих этот обмен. Все без исключения ферменты - это белки и проблема наследственности с позиций молекулярной биологии сводится к вопросу о том, как копируется тот набор белков, который неизменно или почти неизменно воспроизводится из поколения в поколение.
Ген, о природе которого так много спорили, представляет собою отрезок ДНК, соответствующий определенному белку-ферменту. Когда клетка делится, происходит удвоение молекулы ДНК, и каждая дочерняя клетка получает по одной копии материнской ДНК с определенным набором наследственных признаков.
Отсюда следует, что, намереваясь сообщить организму новое наследственное свойство экспериментатор должен ввести в этот организм соответствующий ген или гены (для такой операции уже придумано название - трансгеноз). Но прежде всего нужно получить этот ген либо выделить его из другого организма, либо синтезировать биологическим или химическим путем. Это первая ступень всей операции. Вторая, не менее сложная ступень - введение гена в организм, для чего необходимо владеть, какими-то подходящими методами. И, наконец, третья ступень (пожалуй, менее всего зависимая от экспериментального искусства) - адаптация введенного гена в новом для него генетическом и физиологическом окружении.
Казалось бы, задача ясна. Не нужно, однако, преуменьшать всех трудностей трансгеноза возможно, в, каких-то своих частях он останется невыполнимым ни теперь, ни в будущем. Вот несколько соображений, предостерегающих от чрезмерного оптимизма.
Гены не существуют в организме в виде отдельных структур, но образуют генетический аппарат клетки простой - в виде, например, замкнутой в кольцо нити ДНК у кишечной палочки, более сложный у высших организмов - в виде хромосом, тонкая структура которых еще не раскрыта. Поэтому ген, введенный в организм извне, должен быть встроен в генетический аппарат и должен начать действовать в новом обиталище нормальным образом, производя всю цепь реакций, изображенных на рисунке, начиная от образования мРНК, и кончая синтезом белка. Мало того, белок должен соответствовать по своим свойствам организму, то есть не восприниматься им, как чужеродный и не вызывать у организма развития защитных реакций. Иначе трансгеноз теряет смысл. (См. п. д. л. 1.)
Еще одно не менее важное соображение. Даже у простейших организмов, например, бактерий, генетический аппарат, кроме генов, программирующих синтез белков или нуклеиновых кислот, содержит регуляторные блоки. Они согласовывают деятельность отдельных генов между собою и осуществляют связь генного аппарата клетки с окружающей средой.
Предельной утонченности этот регуляторный отдел генетического аппарата достигает у многоклеточного организма, который проделывает сложный путь развития от оплодотворенной единичной клетки до взрослого организма, состоящего из многих миллиардов различных клеток. Естественно ген-«пришелец» должен, как-то вписаться в существующую систему регуляции, иначе его деятельность может стать неосуществимой или даже вредной.
Сказанное характеризует всю сложность задач, поставленных генной инженерией и пока еще не решенных. Но тем не менее успехи молекулярной генетики позволяют относиться к будущему с известной надеждой.
Начнем хотя бы с вопроса о гене, выделенном или созданном в лаборатории. Впервые ген был выделен в 1969 году. Это сделали американские ученые. Они выделили из кишечной палочки участок ДНК с генами, отвечающими за усвоение кишечной палочкой молочного сахара - лактозы, - так называемый лактозный оперон. При этом была разработана хитроумная техника, в которой использовались фаги (вирусы бактерий) группы лямбда, которые способны встраиваться в ДНК бактерии, а затем при некоторых условиях отделяться, захватывая с собой часть бактериальной хромосомы. Фаги лямбда чаще всего захватывают именно лактозный оперон. Авторы использовали эту особенность фагов для получения изолированного гена. Впоследствии были получены и некоторые другие гены, но более простыми способами.
Второй способ получения гена - его химический синтез. В 1970 году это уже перестало быть фантазией, хотя еще не сделалось до конца реальностью. Американский ученый Хар Гобинд Корана со своими сотрудниками синтезировал ген аланиновой транспортной РНК (тРНК) лекарских дрожжей. (См. п. д. л. 2.)
В свое время работа Кораны наделала много шума и рассматривалась, как подлинный триумф биоорганической химии (таковым она действительно и была). Но вслед за тем наступило разочарование оказалось, что синтезированный Кораной ген не работает в пробирке. Иначе говоря, с его помощью никак не удавалось получить молекулы аланиновой тРНК.
Позже стало ясно, почему. Исследователи Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже нашли, что транспортные РНК синтезируются на гене не в том виде, как они потом существуют в клетках, а в форме предшественника - более длинной цепочки. (См. п. д. л. 3).
Как видим, химический синтез не самый лучший путь получения генов он крайне кропотлив и главное, чтобы синтезировать ген, нужно знать его структуру. Поэтому уже давно, как только возник вопрос о получении генов, стали обсуждать возможные пути их биологического синтеза.
Сейчас разработан весьма эффективный путь такого рода синтеза генов в пробирке. Он связан с увлекательной историей открытия фермента обратной транскриптазы (ревертазы, как ее назвал академик В. А. Энгельгардт). Фермент этот был обнаружен в 1970 году одновременно Теминым и Балтимором и их сотрудниками (США) в онкогенных, то есть вызывающих рак, вирусах.
Это открытие в свое время произвело большое впечатление, потому, что здесь оказались замешанными онкогенные вирусы и одно время казалось, что тайна возникновения рака будет разгадана. Этого не случилось (во всяком случае теперь), хотя представления, касающиеся природы этой страшной болезни, обогатились необычайно. Для нас важно сейчас только одно свойство ревертазы - ее способность осуществлять синтез, обратный тому, который происходит при транскрипции, когда на ДНК образуется матричная РНК (вспомните рисунок в начале статьи).
Следовательно, если в распоряжении исследователя есть матричная РНК, соответствующая определенному гену, то с ее помощью можно воспроизвести этот ген. И такой синтез начиная с 1972 года был осуществлен по крайней мере в семи случаях. Для этой цели были использованы матричные РНК глобина кролика, человека, мыши, голубя, утки (глобин - белок, составная часть гемоглобина), а также белка хрусталика глаза, иммуноглобулина и синтезированы соответствующие ДНК-копии. (См. п. д. л. 4.)
Однако на этом пути не все обстоит так просто, как это может показаться с первого взгляда. Здесь много своих трудностей. Например, в клетках очень невелико содержание матричной РНК. Поэтому трудно из общей массы клетки выделить нужную РНК, всегда есть опасение, что препарат содержит примеси других РНК. У бактерий мРНК к тому же очень нестойки - каждая молекула живет только 1 - 3 минуты.
Нет пока полной уверенности и в том, что полученная путем обратной транскрипции ДНК будет точной копией информационной матрицы и функционально полноценным геном.
В ходе этих опытов было установлено, что другие рибонуклеиновые матрицы являются лучшими матрицами, чем глобиновая информационная РНК, но мы пока еще не знаем, могут ли быть найдены условия, которые были бы равно пригодны для всех матриц. Правда, здесь важна не только количественная сторона, но больше всего качественная копирование должно начаться и закончиться в правильном участке матрицы, ген должен получиться полноценным, работающим. А между тем еще не было сделано функциональных испытаний.
Но не следует быть, с другой стороны, пессимистом, потому, что экспериментальная техника в молекулярной биологии прогрессирует очень быстро и каждый новый факт, касающийся генетических процессов, почти немедленно рождает новые эскпериментальные приемы.
Теперь рассмотрим методы введения в клетку генов, методы трансгеноза, предполагая, что рано или поздно мы будем располагать нужным генетическим материалом.
Молекулярная генетика вирусов, бактерий и клеток высших организмов позволяет уже теперь наметить возможные способы трансгеноза. Это три следующих пути трансформация - перенос генов посредством ДНК, выделенной из клеток и освобожденной от примесей; трансдукция - перенос генов посредством вирусов; гибридизация клеток высших организмов, конъюгация простейших и микроорганизмов.
Итак, первый метод введения в клетку генов - метод трансгеноза. Его наглядно демонстрирует опыт Брэкетта, Баранска, Савицки и Копровски (1971). Согласно их данным, ДНК определенного вируса обезьян - он называется вирус SV40 - проникает в сперматозоид кролика и может быть там обнаружена по радиоактивной метке, которая была предварительно введена в вирус. Более того, можно получить гибрид сперматозоидов кролика, несущих ДНК этого вируса и клеток почки зеленой африканской мартышки и найти в гибридной клетке метку, указывающую на присутствие ДНК вируса.
Еще более необычным было оплодотворение женских половых клеток теми „же сперматозоидами, содержащими вирус SV 40. Оплодотворенные клетки затем выращивали искусственно и спустя некоторое время можно было обнаружить, что они поражены вирусом, который был внесен (это единственный путь) сперматозоидом. (См. п. д. л. 6.)
Эти работы производят убедительное впечатление, но они также ждут подтверждения, как и аналогичные опыты, поставленные на растениях.
Второй возможный путь переноса генетического материала - трансдукция - кажется более обещающим. У микроорганизмов перенос генов с помощью вирусов (фагов) - процесс естественный и, по мнению некоторых, составляет крайне важный способ обмена генетическим материалом между бактериальными клетками. Трансдукция широко и изобретательно применяется молекулярными генетиками для того, чтобы сообщить микроорганизмам новые генетические свойства.
Менее ясно пока использование трансдукции, как способа переноса генов у животных и растений. По-видимому и здесь могут быть найдены вирусы, которые окажутся пригодными для транспортировки генов. У млекопитающих таким вирусом, например, может стать уже упоминавшийся вирус SV40. Для одних видов животных он онкогенный, для других совершенно безвредный, но сохраняет способность проникать в клетку и даже встраиваться в хромосомы.
Здесь возникает вопрос о способе включения генов в вирусные частицы путем химической сшивки их с вирусной ДНК (или другим, каким-либо приемом). Нужно сказать, что генная инженерия больше всего преуспела в разработке методов сшивки генетических структур, в особенности плазмид. Плазмида - это молекула ДНК, существующая у бактерий независимо от хромосомы, автономно. Одна из самых изученных и практически важных плазмид - это плазмида R, от которой зависит устойчивость бактерий к антибиотикам. Этот признак позволяет легко обнаруживать плазмиды и отличать одну от другой в лабораторных опытах.
Американские ученые Коэн, Чанг, Бойер и Хеллинг (1973) попробовали создать гибридную структуру из двух полученных плазмид pSCIOI, сообщающей, бактерии устойчивость к тетрациклину, и RSF1010 - устойчивость к стрептомицину. (Процедура получения гибридной плазмиды изображена на рисунке справа вверху.) Такие синтетические плазмиды могут проникать в кишечную палочку и сообщать ей устойчивость к тетрациклину и стрептомицину одновременно. (См. п. д. л. 7.)
Используя специальные приемы, можно выделить по одному тяжу из ДНК плазмиды RSF1010, и гибридной плазмиды pSC109 и, так сказать, сплавить их в единую структуру. Тогда на снимке в электронном микроскопе можно увидеть своеобразную картину два тяжа, происходящие из плазмиды RSF1010, дадут участок двойной спирали, а тяж, происходящий из pSC101, и не имеющий пары, останется в виде тонкой одиночной нити. Таким образом удается даже разглядеть строение гибридной плазмиды (рис. справа внизу).
Главное в этом опыте заключается в том, что гибридная плазмида получена из двух других не в бактериальной клетке, а в пробирке. Экспериментаторы пользовались выделенными из бактерий плазмидами и ферментами, как обычными реагентами, применяли обычные лабораторные процедуры и оборудование.
Третий путь трансгеноза связан с контактом клеток и передачей генов непосредственным путем. Здесь мы коснемся этой проблемы только применительно к изолированным клеткам животных и растений.
Уже давно в лабораториях выращиваются изолированные клетки. Многие клеточные культуры используются, как для научных, так и для производственных целей. Крупным достижением в этой области стала гибридизация клеток, открытая еще в 1960 году Ж. Барским (Франция). В 1965 году гибридизация обогатилась новым приемом - склеиванием клеток инактивированным вирусом парагриппа типа Сендай. Таким путем могут быть гибридизированы далекие по своему биологическому происхождению клетки, например, мыши и человека, москита и человека, нормальная клетка и опухолевая клетка, и т. д. Как видим, к задачам генной инженерии это имеет самое непосредственное отношение.
Действительно, проще всего представить себе операцию трансгеноза так берут полноценный ген, или хромосому, или ядро, содержащее этот ген и вводят в культивируемую лабораторно клетку, взятую от растения или животного. Потом клетку, получившую ген, культивируют некоторое время на искусственной среде. Убедившись, что внесенный ген нормально функционирует, клетку вводят в организм.
Пока такая процедура невыполнима, но первые подходы к ней уже осуществлены.
Вот один из примеров. Были взяты две линии мышей нормальная, клетки которой вырабатывают белок MuB1, и мутантная, не вырабатывающая такого белка. От этих мышей были взяты клетки селезенки (нормальная линия), и почки (мутантная линия). Клетки некоторое время выращивали в культуре, а затем гибридизировали с помощью обычных приемов. Полученные клетки объединили в себе (по крайней мере отчасти) свойства родительских. Было доказано, что гибридные клетки вырабатывают белок MuB1 в пробирке. Но этого мало. Введенные в кровеносную систему мутантных мышей, они в течение 21 дня вызывали образование доселе отсутствовавшего белка.
Большое будущее у методов клеточной хирургии, позволяющих пересаживать клеточное ядро. Близкие приемы разработаны в генетике млекопитающих. Когда еще не произошла специализация клеток, оплодотворенные яйцеклетки извлекают из матки двух беременных мышей, отличающихся по наследственным свойствам, обрабатывают ферментом, расщепляющим белки, в результате чего оболочки клеток растворяются и цитоплазма их сливается. Теперь клетки, взятые от разных мышей, развиваются далее, как единое целое, введенные в матку мыши, они дают затем жизнеспособное потомство.
От обычных животных такие гибридные мыши отличаются тем, что они являются «мозаичными» особями - у них отдельные признаки, унаследованные от родителей, не сливаются, давая нечто отличающее детеныша от любого из родителей, как это бывает обычно. Здесь же мы видим мозаику независимых признаков. Например, мышь, происходящая из гибридизированных клеток белых и черных родителей, имеет белую в черную полоску шкурку.
Какие возможности сулит человечеству генная инженерия?
Вероятно, первым практическим приложением приемов генной инженерии станут некоторые наследственные заболевания человека и полученные в лаборатории гены будут использованы для лечения, которое можно назвать генотерапией.
Наследственные заболевания человека, относящиеся к врожденным нарушениям обмена веществ, - результат строго определенного дефекта - неспособности синтезировать тот или иной белок, тот или иной фермент, необходимый для нормального течения химических превращений, из которых складывается обмен веществ человека. Это значит, что определенный ген, когда-то был поврежден мутацией, и с тех пор этот дефект передается по наследству.
Большинство наследуемых свойств человека относится, однако, к полигенным признакам, то есть они зависят от нескольких, иногда многих генов. В этом случае наследственные различия имеют количественный характер в отличие от наследуемых дефектов обмена, где господствует закон «все или ничего»
В настоящее время известно свыше 1 000 наследственных нарушений обмена и более чем в 100 случаях точно установлено, какой именно ген поврежден, какой фермент, гормон или транспортный белок не вырабатывается в организме в нужном количестве или имеет дефект. Многие врожденные нарушения обмена приводят к тяжелым последствиям, хотя все они заключаются в дефекте, казалось бы, незначительном - отсутствии в клетках организма, какого-то белка (фермента). Тяжесть последствий зависит от того, что ген был дефектным уже в исходной яйцеклетке, из которой путем многократных делений развивается взрослый организм и поэтому все до одной клетки, его образующие, приобретают тот же недостаток.
Примером наследственного заболевания является галактоземия, когда в организме отсутствует фермент с длинным названием галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза, без которого невозможно нормальное усвоение молочного сахара, содержащегося в грудном молоке. Точнее сказать, не усваивается только входящая в состав молочного сахара галактоза. Она, и ее производные накапливаются в клетках печени, головного мозга и других органов. Последствия имеют катастрофический характер - слабоумие, повреждение печени, слепота и другие тяжелые расстройства и, наконец, ранняя смерть.
Развитие болезни можно предупредить, устраняя из питания младенца грудное молоко (став взрослым, он легко может обойтись без молока, коровьего и любого другого). Таким путем преодолевают последствия наследственного недостатка при галактоземии. Но в большинстве случаев практически не существует способов борьбы с врожденным недостатком обмена. Пытались вводить в организм сам фермент (вводят же диабетикам гормон инсулин, cкоторый у них отсутствует), но ферменты, увы, химически нестойки и они легко разрушаются. В некоторых случаях пробовали лекарственное лечение, но с ограниченным успехом.
С этой точки зрения, генотерапия кажется радикальным и обещающим способом борьбы с врожденными недостатками обмена.
Первая такая попытка была сделана в 1971 году. Свой эксперимент Меррил, Гейер и Петричиани провели на соединительнотканых клетках человека, выращиваемых в лабораторных условиях. Клетки были получены из кожи человека, страдающего галактоземией, в которых, как уже говорилось, отсутствовал фермент, усваивающий галактозу. Экспериментаторы взяли обычную кишечную палочку, обладающую всем набором генов, необходимых для усвоения молочного сахара, как источника углерода. Перенос этого гена в человеческие клетки был осуществлен при помощи фага лямбда, который при некоторых условиях способен встраиваться в хромосому кишечной палочки близ гена усвоения галактозы; переходя затем в свободное состояние, он захватывает соседний участок хромосомы, содержащий этот ген. Меррил и его коллеги смешали в склянке клетки человека, лишенные гена усвоения галактозы и частицы фага лямбда, которые содержали этот ген, заимствованный от кишечной палочки.
Меррил утверждает, что в результате были получены галактоземические клетки, содержащие нужный ген, который воспроизводился при размножении клеток по крайней мере в течение 8 недель. К сожалению, этот опыт в дальнейшем не удалось воспроизвести и таким образом осталось неясным, был ли он ошибочным или впоследствии упустили, какую-то важную деталь в его постановке, на которую исследователи в свое время не обратили внимания.
В заключение несколько слов о такой важной проблеме, как фиксация атмосферного азота растениями.
Способность фиксировать азот, насколько это известно сейчас, свойственна только некоторым бактериям, свободно живущим в почве и существующим в симбиозе с высшими растениями.
Современное земледелие вносит в почву огромное количество минерального азота в виде удобрений для восполнения тех 110 миллионов тонн азота, которые, как говорят некоторые подсчеты, ежегодно выносятся из почвы культурными растениями. И это особенно необходимо сейчас, в век высокоинтенсивного земледелия, в век «зеленой революции», потому, что всякое новое повышение продуктивности растений человек оплачивает увеличением вносимых в почву удобрений.
Это тяжелое экономическое бремя и естественно стремление максимально использовать природный процесс фиксации атмосферного азота. Представители разных специальностей идут в этих поисках неодинаковыми путями агроном думает об увеличении посевов люцерны и вики, микробиолог ищет в окружающей среде новые азотфиксирующие бактерии, молекулярный биолог, конечно, мечтает о пересадке гена фиксации азота. Однако биохимическая и генетическая стороны азотфиксации еще не вышли из стадии младенчества. Химизм фиксации азота еще плохо изучен, но едва ли в наследственном аппарате азотфиксирующей бактерии существует только один ген, относящийся к этому процессу, скорее всего их несколько, целый комплекс.
Новые перспективы открылись в этой области в связи с успехами лабораторного культивирования растительных клеток. В последние годы получены культуры протопластов, то есть клеток, лишенных жесткой целлюлозной оболочки. Уже удалось слиянием протопластов получить неполовым путем растительные гибриды и это приблизило возможность переноса в растение генов фиксации атмосферного азота бактерий.
Обещающие шаги в этом направлении сделали английские исследователи Дж. Постгейт и Диксон. Их опыт, однако, был поставлен не на растениях, а на бактериях. Для этого были взяты одна из бактерий рода клебсиелл, обладающая способностью к азотфиксации и содержащая нужные для этого гены и кишечная палочка, не фиксирующая азота. Обе эти бактерии относятся к одному семейству и поэтому они могут, хотя и редко, соединяться плазматическими мостиками и в таком состоянии обмениваться генетическим материалом - ДНК. Постгейт и Диксон установили, что при таком обмене кишечная палочка получает от клебсиеллы гены азотфиксации и становится азотфиксатором.
Практического значения этот замечательный опыт не имеет. Он важен, как доказательство возможности переноса всего комплекса генов азотфиксации от одной бактерии к другой.
Дальнейшее развитие этих исследований пока неизвестно. Большие возможности откроются, если окажется, что ДНК, несущая гены азотфиксации, образует в кишечной палочке автономную структуру - плазмиду. Тогда перенос генов азотфиксации в другие бактерии будет очень вероятным.
Таково положение генной инженерии на сегодняшний день. Оценка приведенных выше фактов может быть различной. Скептическое отношение к практическим возможностям этого нового направления имеет свои основания, так, как здесь человек вторгается (пока, нужно признаться, весьма грубо) в сферу сложнейших и тончайших биологических процессов. Но еще более обоснован оптимизм, который зиждется на первых обнадеживающих шагах и на том бесспорном факте, что прогресс биологии за последнее время превосходит все то, о чем можно было только мечтать 20 лет назад.
ПОДРОБНОСТИ ДЛЯ ЛЮБОЗНАТЕЛЬНЫХ
Реализация генетической информации в клетке начинается с того, что в ядре снимается копия ДНК в виде информационной, или матричной, РНК (мРНК), - этот процесс назван транскрипцией. Синтез белка (трансляция) происходит уже за пределами ядра, в цитоплазме клетки на информационной РНК. При считывании генетической информации, содержащейся в мРНК, которую можно уподобить телетайпной ленте, заключающей некоторое сообщение, каждой тройке нуклеотидов (кодону), составляющих мРНК, соответствует строго определенная аминокислота в белке. Таким путем последовательность нуклеотидов, содержащихся в ДНК, через посредство мРНК, предопределяет последовательность аминокислот в ферментном белне, а следовательно и свойства последнего.
Задача заключалась в том, чтобы синтезировать из 77 дезоксирибонуклеотидов цепочку ДНК, комплементарную к аланиновой тРНК, как это показано ниже. Так, как ДНК является двутяжевой структурой, то необходимо было синтезировать и вторую нить, комплементарную к первой.
Вот схема синтеза гена аланиновой транспортной РНК. Показан только отрезок гена с 1-го по 10-й нуклеотид А, Г, Ц, У, Т - символы нуклеотидов, составляющих цепочки нуклеиновых кислот; в РНК это рибонуклеотиды, в ДНК - дезоксинуклеотиды. Комплементарные пары А - Т или А У, Г Ц.
Так тирозиновая транспортная РНК кишечной палочки, состоящая из 85 нуклеотидов, копируется с соответствующего гена в виде молекулы в 126 нуклеотидов, то есть она на 41 нуклеотид длиннее. Затем избыточные нуклеотиды отщепляются специальным ферментом - получается законченная молекула тирозиновой тРНК, более короткая, но способная для выполнения своей физиологической роли. Данные Кембриджской лаборатории были учтены Кораной и совсем недавно он сообщил, что в его лаборатории синтезирован ген тирозиновой тРНК, соответствующий ее предшественнику. Это спиральный двутяжевой полинуклеотид, состоящий из 126 пар нуклеотидов.
Но, увы и этого еще недостаточно, чтобы получить матрицу, на которой смогли бы синтезироваться ее копии в соответствующих условиях. Синтез тРНК в бактериальной клетке осуществляется специальным ферментом - РНК-полимеразой, для которого на матрице есть два участка - один в начале гена для присоединения фермента и второй в конце - он служит сигналом завершения синтеза. Протяженность и строение этих вспомогательных участков до сих пор окончательно не были известны. Таким образом, синтез гена тирозиновой тРНК еще не закончен, но это только вопрос труда и времени, по-видимому, принципиальных препятствий для завершения работы уже нет.
К мРНК глобина кролика добавляют «затравку» - дезокситимидиловую кислоту (Т). Она образует комплекс с остатками адениловой кислоты (А), с которых начинается глобиновая мРНК. В присутствии фермента из добавленных нуклеозидтрифосфатов происходит построение копии ДНК, которая отделяется при обработке щелочью.
Вот описание еще одного эксперимента, иллюстрирующего метод переноса генов с помощью ДНК.
В этом исследовании (его авторы Хилл и Хиллова) на искусственной среде выращивались клетки зародыша цыпленка. В какой-то момент к ним добавляли бромдезоксиуридин, который включался во вновь синтезированные нити ДНК - таким образом по этой метке можно было отличить новые (синтезированные за время наблюдения), и старые нити ДНК. В эту же среду одновременно добавляли ДНК, полученную от мыши и меченую тритием (Н3) для того, чтобы можно было отличить мышиную ДНК от ДНК цыпленка, которая была либо немеченой, либо содержала в качестве метки бром. Затем клетки выдерживали 21 час (они эа это время нормально размножались), после чего из них выделяли ДНК, и выявляли, как распределяется бром (метка ДНК цыпленка), и тритий (метка мышиной ДНК) во вновь образовавшейся ДНК.
Первый этап - выделение плазмид RSF1010, и pSCIOI из кишечной палочки. Это двутяжевые спирализованные колечки ДНК с молекулярным весом около 6 х10е и длиной по окружности около 3 микрон. Действуя затем на них ферментом эндонуклеазой EcoR[, получали разрывы каждого из двух тяжей, образующих кольцо, после чего молекулы становились линейными. Особенность эндонуклеазы EcoRI та, что она дает концы, способные сливаться, поэтому после смешивания линейных молекул pSCIOI, и RSF1010 эти концы слипаются. При этом возможны три исхода молекула может замкнуться на себя и дать исходное кольцо; она может соединиться с себе подобной и, наконец, с чужой молекулой. В последнем случае получается гибридная молекула pSC109, которая в пробирке под влиянием еще одного фермента (полинуклеотидлигазы) даст прочное замкнутое кольцо. Молекулярный вес его вдвое больше. Синтетические плазмиды могут проникать в кишечную палочку и сообщать ей устойчивость к тетрациклину и стрептомицину одновременно.
Операция начинается с того, что, действуя определенным ферментом (эндонуклеазой RI кишечной палочки), получают разрыв колец и притом в одном только месте. В результате молекулы из кольцевых превращаются в линейные. Далее ферментом экзонуклеазой фага лямбда укорачивают нити ДНК с противоположных концов. Затем проделывают наиболее деликатную операцию - наращивают нити ДНК, пользуясь специальным ферментом, концевой трансферазой. У одной ДНК эти новые концы состоят из адениловых остатков (А), у другой - из тимидиловых остатков (Т). При смешивании молекул концевые остатки А, и Т образуют комплементарно пары, тем самым замыкая линейные молекулы в кольца. Вначале эти кольца содержат 4 разрыва, которые затем закрываются химической связью под действием еще одного сЬермента. Так была получена гибридная молекула, состоящая из двух вирусных ДНК, и галактозного оперона кишечной палочки.
