Выращивание изолированных тканей и клеток растений открыло новую и интересную страницу в исследовании важнейшей биологической проблемы - в познании законов развития высших организмов.
Как, и всякое крупное теоретическое и методическое достижение, культура клеток растений очень скоро внесла заметный вклад в практику народного хозяйства. Культура тканей и клеток становится теоретической основой прикладной генетики и селекции растений и открывает большие перспективы в расширении сырьевой базы для биосинтетической промышленности.
В Советском Союзе эти работы широко ведутся в Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева АН СССР, в лаборатории, руководимой профессором Р. Г. Бутенко.
Прошло сравнительно немного лет после создания клеточной теории (дата ее рождения - 1838 год), а исследователей уже больше не удовлетворяет простое описание разнообразных типов клеток. Их давно не удивляет стройная организация животных и растений на клеточном уровне. Им хочется понять механизмы этой организации. Скажем, очевидно, что совместное взаимосогласованное сотрудничество клеток поддерживает жизнь организма, как целого, и, что все клетки подчинены контролю организма. Но неясно, насколько сильна связь между этими отдельными клетками, так ли уж они зависят друг от друга? Наблюдения за жизнью одноклеточных организмов приводят к мысли, что многоклеточное сотрудничество совсем необязательное условие жизни.
А что, если отдельную клетку (или отдельные клетки) вырвать из многоклеточного организма и заставить жить вне его, хотя бы час, сутки, неделю?
О важности решения этой задачи писал еще в 1902 году ботаник Габерландт «Культивирование изолированных клеток в питательных средах обеспечит экспериментатору по меньшей мере подход ко многим важным проблемам с совершенно новой точки зрения»
Первыми клетками, которые ученым удалось заставить жить в искусственных условиях, были клетки, взятые не у растений, а у животных.
Сообщение об этом научном достижении появилось в 1907 году. В нем речь шла о нейробластах лягушки - выделенные из организма нервные клетки росли и развивались несколько недель.
Ботаникам же подобные эксперименты долго не удавались. Чисто механически перенять методы, применяемые в работе с животными клетками, они не могли. Растительные клетки в этом смысле оказались более «капризными». Например, при культивировании животных клеток вопрос о подборе для них питательной среды решался просто кровь и лимфа, которые омывают в организме клетки и поставляют им все необходимые питательные вещества и есть готовая питательная среда. У растений эта система несколько иная. Транспортируемые по сосудам растения вещества большинство клеток получает путем диффузии через соседние клетки и ткани. Надо было искусственно создать подобный «сок», чтобы обеспечить питание клеток в пробирке.
Вторая трудность вызвана тем, что уже сам процесс изолирования клеток растений проходит более болезненно, поскольку связь между клеточными стенками у растений несравненно более прочная, чем у клеток животных. И, наконец, еще один барьер клетки растений, уже дифференцированные внутри организма, то есть определившие свою принадлежность к различным его частям, теряют способность к делению, свойство это сохраняется лишь у клеток специальных тканей, называемых меристемами. У животных, как правило, все клетки сохраняют способность делиться. (Именно это обстоятельство и было одной из причин неудач опытов Габерландта. Свои опыты он проводил на клетках зеленых листьев, которые уже утратили способность к активному делению.)
К началу 30-х годов относятся первые успехи ботаников в этой области. Исследователи к этому времени уже не пытались ставить эксперименты со специализированными тканями. Их внимание привлекли клетки, которые образуют тканевые наплывы в месте повреждения растения, например, на стволах у деревьев. Эти удивительно неприхотливые ткани, возникающие, как защита в ответ на различного рода травмы, легко поддаются культивированию в искусственных условиях. Надо только изолировать кусочки стебля, корня или листа, поместить их на питательную среду и через неделю на раневой поверхности появится бесформенный тканевый наплыв - каллус.
Клетки такой каллусной ткани развиваются в колбах или пробирках в виде неорганизованной, быстро растущей массы. Периодически отделяя и перенося кусочки каллуса на свежую питательную среду, можно продлить жизнь растения на неопределенно длительное время. В лабораторных коллекциях есть ткани, живущие в культуре уже более 30 лет.
Интересно, что по способу питания культура ткани отличается от целого растения. Если целое растение является автотрофом, то есть само обеспечивает себя органическими веществами, создавая их в процессе фотосинтеза, то культура ткани - это типичный гетеротроф, напоминающий животные организмы, которые живут за счет питания, Поступающего извне. Поэтому, создавая питательную среду, ученые должны были учитывать и компоненты, которые растение получает из почвы и то, что оно синтезирует' из углекислого газа и воды в клетках зеленого листа, а именно углеводы. Клетки будут жить и делиться только в том случае, если питательная среда содержит все элементы минерального питания (N, Р, К, Mg, Са, S, Мп, Zn, и другие), углеводы, например, сахарозу или глюкозу, а также различные стимулирующие вещества - витамины и гормоны.
Годы упорных поисков были вознаграждены в настоящее время в различных лабораториях мира растут изолированные ткани многочисленных представителей растительного царства. В колбах и пробирках этих коллекций можно встретить ткани табака и ели, экзотического реликтового растения - гингко, и «корня жизни» - женьшеня, ткани, полученные из пыльников томата, плода лимона и многие другие.
То, что мы называем культурой ткани, - это колония клеток. А можно ли пойти дальше и изолировать одну клетку? В работах разных лабораторий было показано, что отдельная, изолированная клетка может расти только в непосредственной близости других клеток или на среде, содержащей продукты их жизнедеятельности. Такая группа клеток, стимулирующая деление отдельной клетки, получила название ткани-няньки.
За счет чего ткань-нянька создает это стимулирующее влияние? Вопрос о природе стимулов вызвал новую волну экспериментов. И они однозначно показали, что стимулирующее влияние ткани-няньки пока нельзя искусственно заменить набором известных физиологически активных веществ - витаминов, аминокислот, фитогормонов. Диффузия их через полупроницаемые мембраны хотя и возможна, но замедленна. Анализ состава воздуха в сосудах для культивирования клеток в жидкой среде также не обнаружил в нем загадочных стимуляторов. В настоящее время предполагают, что фактором, побуждающим клетку к делению, может быть вещество типа ЦАМФ, - оно играет роль медиатора - посредника - в действии растительных и животных гормонов на генетический аппарат клетки.
Ставились новые эксперименты и выяснилось, что клетки вне организма обнаруживают некоторые особенности, не свойственные клеткам, входящим в целое растение. Поведение каждой клетки в организме подчиняется задачам, продиктованным ей целым растением (клетки листа, корня, цветка выполняют свою «работу»), а выделенная из пего, она уходит из-под контроля и приобретает «независимость». Например, очень скоро стало известно, что изолированная клетка, утратив первичную специализацию и те свойства, которыми она первоначально обладала, как часть целой системы, способна встать на путь новой специализации и даже дать начало новым тканям, органам и целому растению. Изолированная клетка, выращиваемая в пробирке, после ряда делений может образовать отдельные элементы сосудистой системы растения. В определенных случаях перенесенная на свет обычно бесцветная каллусная клетка зеленеет, - значит, в ней образуется хлорофилл и создается фотосинтетический аппарат. Более того, всеми этими процессами можно управлять, изменяя состав среды, в которой развивается клетка определяющую роль в регуляции дифференцировки играют гормоны растений - ауксины, цитокинины и гиббереллины.
Существует даже теория о значении гормонального баланса при различных путях дифференцировки в культуре ткани. Согласно этой теории, корень образуется в том случае, если соотношения гормонов ауксина и кинетина в питательной среде сдвигаются в сторону преобладания ауксина, а стебель - когда увеличивается содержание цитокинина. Когда же гормональный баланс усреднен, каллусная ткань растет, не дифференцируясь.
Механизмы этой тонкой внутриклеточной регуляции дифференцировки представляют одну из самых интересных загадок, которую нужно раскрыть физиологам и биохимикам растений. И тогда перед человеком действительно откроются фантастические возможности управлять целенаправленно природой растений.
Способность растительной клетки легко превращаться и давать начало той или иной системе органов показывает, что любая специализированная клетка содержит весь набор генов, кодирующих ее развитие в любом направлении. Данное положение было подтверждено еще одной серией блестящих экспериментов, проведенных независимо советским биологом Р. Г. Бутенко и американским исследователем Ф. Стюардом.
В их работах было показано, что каллусная клетка способна превратиться в клетку, дающую начало зародышу растения. Такая клетка функционально подобна оплодотворенной яйцеклетке или зиготе, хотя ее появлению и не предшествовало слияние спермин с яйцеклеткой - она возникла в результате деления не половых клеток. Это явление названо соматическим эмбриогенезом в культуре ткани.
Наиболее полно оно было изучено в культуре ткани моркови. Наблюдая за поведением клеток в пробирке, можно видеть, как в массе однородных каллусных клеток появляется одна, которая начинает превращаться в типичную зиготоподобную клетку с обогащенной цитоплазмой и увеличенным ядром. Последующее поведение этой клетки, например, тип делений или ориентация делений, идет по пути развития зародыша в завязи цветка. Разница только в том, что нет ни цветка, ни растения, а развивающийся зародыш, окруженный каллусными клетками, находится в пробирке. Его развитие проходит типичные стадии глобулярную, сердцевидную и торпедовидную (они так названы, поскольку внешне напоминают шарик, сердечко, вытянутую торпеду). Замечено, что при переходе от глобулярной стадии к последующим часто меняется отношение зародыша к содержанию в среде гормонов, - так, если первоначальные этапы процесса стимулируются высокими концентрациями ауксина, то после стадии глобулы ауксин нужно удалить из среды. На стадии сердцевидного зародыша закладываются будущий корень, почечка, необходимая для роста будущего стебля и одновременно происходит образование первых листьев, называемых семядолями.
Сформировавшийся зародыш уже можно выделить из окружающей его каллусной ткани и поместить в среду без гормонов, поскольку этот маленький растительный организм уже сам их синтезирует. Теперь он быстро развивает нормальную корневую систему, сначала семядольные, а затем типичные для моркови рассеченные листья. Перенесенные в почву, эти миниатюрные растеньица дают начало нормальным растениям, образующим корнеплод и розетку листьев. Позднее, как истинный двулетник, такое растение моркови образует стебель-цветонос и зацветает.
Метод культивирования изолированных клеток открыл неожиданные перспективы для изучения взаимоотношений между структурами, составляющими клетку. Этот новый этап в изучении клетки начался совсем недавно с изолирования так называемых растительных протопластов.
Изолированный протопласт - это клетка, лишенная внешней целлюлозно-пектиновой оболочки. Получающиеся при этом «голые», окруженные лишь внешней клеточной мембраной клетки имеют удивительные свойства. Прежде всего следует отметить их способность к слиянию. В результате возникает продукт, содержащий генетический материал различных исходных клеток. Затем такой гибридный протопласт можно заставить восстановить - синтезировать - клеточную стенку. И вот перед нами снова обычная по внешнему виду клетка, культивируемая в пробирке и способная образовать целое растение, но уже гибридное.
Культура изолированных протопластов, используемая для гибридизации, дает человеку возможность «перехитрить» природу. Ведь можно в принципе слить изолированные протопласты, полученные из клеток не только разных видов и родов растений, но даже разных семейств. Правда, судьба таких гибридных клеток пока еще не ясна. Но одно бесспорно этот метод открывает широчайшие возможности для гибридизации, помогая преодолевать несовместимость родительских форм в половом процессе.
Другое важное свойство изолированных протопластов - их способность «заглатывать» из раствора различные макромолекулы и частицы. Пользуясь таким свойством, можно ввести в клетку генетическую информацию и даже целые клеточные частицы - ядра, хлоропласты, митохондрии, выделенные из другого организма. После такой операции клетка часто не разрушает полученные извне «запасные части», а включает их в свой механизм. Опыты по пересадке в клетку чужих хлоропластов показали, что пересаженные пластиды размножаются внутри клетки. Поэтому, если пересадить хлоропласты, взятые из нормального зеленого растения, в протопласты из листа, в котором нарушен синтез хлорофилла, то после ряда превращений «прооперированные» клетки начинают фотосинтезировать, используя для процесса чужие органеллы.
Работа клетки - это, в сущности, взаимодействие клеточных органелл, и, изучая процессы их взаимодействия, ученые продвигаются к пониманию механизмов жизнедеятельности. Сейчас уже делаются попытки культивировать отдельные клеточные органеллы. Известно, например, что митохондрии и хлоропласты содержат собственную ДНК, и систему, синтезирующую белок, хотя для нормальной их работы необходимы также гены ядра (иначе говоря, хлоропласты и митохондрии полуавтономны).
Все эти свойства дают возможность экспериментаторам манипулировать с клеточными органеллами, например, собирать клетку из разных частей, обладающих теми или иными свойствами. Открываются буквально фантастические перспективы в области изучения тонких субклеточных структур растительной клетки, их взаимоотношений и индивидуальных особенностей. А это, в свою очередь, позволяет ученым изучать жизнедеятельность целого организма, глубоко проникая в механизмы его роста и развития. Не надо забывать, что конечная цель таких экспериментов - разработка наиболее рациональных способов управления жизнедеятельностью и продуктивностью растений.
Мы уже отмечали, что клетка в пробирке таит в себе потенции, свойственные целому организму; сохраняет она и особенности обмена веществ, свойственные ему. Выяснилось, что изолированные из организма клетки синтезируют не только вещества, нужные ей для поддержания роста и размножения, но также и многочисленные так называемые вторичные продукты, представляющие уникальную ценность для человека.
Эта способность быстро размножающейся в пробирке клетки к биосинтезу специфических химических веществ позволяет получать (пока еще только в лабораторных условиях) ценные продукты метаболизма и прежде всего лекарственные соединения. Привлекает здесь и то, что можно культивировать ткани тех растений, запасы которых в мире ограничены либо истощаются. Для нашей страны важно, например, перевести в клеточную культуру растения, не произрастающие в условиях климата СССР, а также те, которые представляют большой экономический интерес. Вот некоторые из них раувольфия, являющаяся единственным источником резерпина; диоскорея, синтезирующая стероидные соединения, - ключевые в синтезе кортизона и других гормональных препаратов, и, наконец, женьшень.
Ценность женьшеня известна с глубокой древности. Но этот ценный дикарь капризен и плохо растет. А вот клетки того же самого женьшеня, который крайне медленно растет в естественных условиях (прирост - 1 грамм в год), в пробирке быстро образуют большую биомассу (100 граммов на литр питательной среды за 21 день), и синтезируют те же панаксозиды, что и целое растение.
В коллекции культуры тканей Института физиологии растений АН СССР, кроме разных видов женьшеня, есть ткани таких экзотических растений, как упомянутые раувольфия и диоскорея, ткани кендыря и листа строфанта, наперстянки и барвинка розового.
Ткани женьшеня и диоскореи, пожалуй, одни из самых перспективных для промышленного выращивания. Теперь уже реально существует возможность получать продукты жизнедеятельности этих растений, выращивая их клетки в ферментерах (аналогичным образом в микробиологической промышленности получают пенициллин и его производные). А пока биоинженеры, физиологи и биохимики занимаются поисками наиболее продуктивных клеточных штаммов, физиологических условий, обеспечивающих интенсивный рост тканей и синтез биологически активных соединений, создают аппаратуру для выращивания клеток в промышленной культуре.
Наконец, несколько слов о тех практических приемах, которые метод выращивания тканей и клеток в пробирках предлагает сельскохозяйственной науке.
Культура изолированной верхушечной меристемы стебля позволяет размножить генетически ценный материал и оздоровить его от вирусных заболеваний. В нашей стране, так же, как и в ряде других стран, здоровый посадочный материал (садовой земляники, малины, картофеля, декоративных растений и др.) получают методом культуры меристемы. Изолированный из верхушечной почки кусочек меристемы величиной, измеряемой долями миллиметра, образует в пробирке растение, свободное от вирусов. Из этого растения в условиях культуры можно получить сотни здоровых растений, которые затем будут выращивать в почве.
Способность растительной клетки давать в пробирке целое растение открыла широкие возможности для применения этих методов в генетико-селекционной работе. Особенно ценна в настоящее время возможность получать гаплоидные растения через культуру пыльников. Гаплоидные растения имеют один набор хромосом. Если его удвоить, то получаются нормальные растения с нормальным двойным набором хромосом, но наборы эти совершенно одинаковы. Такие гомозиготные линии очень ценны для последующей гибридизации, так, как скрещивание гомозиготных форм дает высокопродуктивные формы. Применение гаплоидов ускоряет и облегчает генетико-селекционный процесс.
Если представить себе будущее этого направления науки, то, фантазируя, можно предположить создание принципиально новых биосинтезирующих систем, сконструированных в пробирке введением чужеродных генов в растительную клетку. Это может придать клетке высшего растения способность использовать недоступные ей сейчас субстраты для синтеза цепных веществ, сделать клетку более устойчивой, или, например, придать ей способность усваивать атмосферный азот. И, наконец, можно представить в будущем конструирование искусственных биосинтезирующих систем с использованием клеточных органелл и биомембран.
ЛИТЕРАТУРА
Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей растений и физиология морфогенеза. М. «Наука», 1964.
Бутенко Р. Г. От свободноживущей клетки - к растению. М. «Колос» 1971.
«БИОЛОГИ МОДЕЛИРУЮТ РАСТЕНИЯ» Так называется научно-популярный фильм, рассказывающий о работах советских ученых с культурой ткани растений. (Автор и режиссер фильма В. К. Астафьев, операторы Н. С. Попов и Г. В. Боярский. Фильм выпущен студией Центрнаучфильм в 1972 году.) На цветном развороте представлены кадры из этого фильма, которые показывают последовательные этапы развития целого растения из каллусной ткани.
Вторая тема цветного разворота - выращивание орхидей методом изолированной культуры ткани (методом меристемы). Эти работы ведутся во Франции исследователями Национального института агрономических исследований. Их достижения коротко характеризуются такой сенсационной фразой «В настоящее время из одного стебля орхидеи можно получить за год около 2 миллионов этих прихотливых и трудных в выращивании растений»
Под микроскопом срезается кусочек меристемы орхидеи в питательной среде он уже через несколько дней начинает развиваться. Причем каждый вид орхидей имеет свои особенности - у одного вида для целей бесполого размножения надо взять не только ткань верхней части стебля, но и срезы листьев, у другого - целую почку, у третьего - срез кожицы, и т. д. На развивающейся культуре образуются мельчайшие луковички, некоторые поверхностные клетки которых обладают способностью к регенерации. Выделенные и пересаженные в питательную среду, они дадут второе поколение стеблей - отправной точки будущего растения. И так далее. Этот процесс бесконечен.
