Они живые и светятся

Зачем сибирским земляным червям потребовалась биолюминесценция? Разобраться в этом вопросе пытаются исследователи Красноярского научного центра СО РАН.

— Если черви светятся, значит, наверное, им это для чего-то нужно… Но для чего именно?

— Это интересный вопрос. На сегодняшний день известно около двух десятков видов светящихся кольчатых червей — правда, в основном, тропических. Даже в Сибири были найдены четыре биолюминесцентных вида, в том числе Fridericia heliota и два недавно открытых родственных вида Henlea: H.petushkovi и H.rodionovae.  Эти земляные черви широко распространены в Красноярском крае и Иркутской области, их можно найти даже в обычном огороде.

Но до сих пор непонятно, как и сколько раз возникала биолюминесценция в ходе эволюции, сколько всего существует вариантов биолюминесценции. Известно несколько биологических функций биолюминесценции: привлечение добычи, коммуникация и привлечение брачных партнёров, определение свой/чужой, привлечение в ночное время насекомых — переносчиков спор, отпугивание хищника, отвлечение врага, маскировка на фоне естественных источников света... Но роль биолюминесценции в жизни многих светящихся организмов так и остаётся загадкой.

Что касается червей, то, например, с морскими полихетами всё понятно. Им биолюминесценция нужная для размножения. Так, у морских полихет рода Odontosyllis существует брачный ритуал, который происходит каждый месяц в период полнолуния, через 55 минут после астрономического захода солнца и длится от 10 до 30 минут. На это биолюминесцентное шоу туристам продают билеты и привозят на корабликах в нужное место. Самки Odontosyllis enopla начинают плавать медленными кругами у поверхности воды, выделяя при этом яркую голубовато-зелёную светящуюся слизь. Самцы резко поднимаются из глубины и плывут к самкам, испуская короткие импульсы света. У взрослых O. enopla есть четыре глаза. И хотя самцы этих полихет меньше самок, глаза у них крупнее и настроены на длины волн свечения самок. В брачном танце все участники выпускают свои гаметы. Шоу длится от 10 до 30 минут, после чего всё резко прекращается.

— Ну а с земляными червями есть какая-то ясность? Что случилось бы, перестань они светиться?  

— Зачем светятся земляные черви, мы пока не знаем. Тропические светящиеся черви, наши Henlea sp. и  Microscolex phosphoreus, впервые обнаруженные в Сибири, выпускают светящуюся слизь. Поэтому для них можно предположить поиск партнёра по светящемуся следу в земле или тоже брачные игры в воде.

Биолюминесцентные черви, обнаруженные в Сибири. Илл.: Родионова Н., Петушков В.,ФИЦ КНЦ СО РАН.

Но! Эти черви не имеют глаз, только светочувствительные клетки, что достаточно для отрицательного фототаксиса — они отползают от яркого света в укрытие, но недостаточно для того, чтобы видеть биолюминесценцию слизи. Да и намного проще находить след по химическим меткам слизи, без всякого свечения.

Возможно, свойство биолюминесценции осталось у этих червей как атавизм с тех давних времён, когда они были глазастыми и резвились в воде. Но за миллионы лет ненужная способность отпала бы, ведь она энергозатратна. В общем, сплошные загадки!

— Выходит, сибирским земляным червям нужна слизь, чтобы светиться?

— Не всем. Например, таёжная Fridericia heliota или французская Avelona ligra светятся сами, без испускания слизи. Партнёра в земляных ходах они точно не увидят. Отпугивать хищника? Фридериции маленькие, какому-нибудь жуку или кроту выгоднее сожрать крупного дождевого червя, чем эту мелочь. Наши французские коллеги, снявшие чудесный фильм BBC о биолюминесценции («Life that Glows»), считают, что червь Avelona ligra светится, потому что «свечение отпугивает хищника, и земляной червь таким образом спасается», но камера показывает, что жужелица не обращает на свечение никакого внимания и продолжает свой обед.

Так что мы пока сами не знаем, зачем биолюминесценция нужна земляным червям, и что было бы, если бы они вдруг лишились этих свойств. Хотя в шутку можно сказать, что черви светятся для красоты. Ведь это действительно волшебное зрелище, впечатляющее каждого, кто его увидел воочию!

— Какие новые свойства этих организмов вам удалось обнаружить?

— Во время работы по мегагранту (СибФУ 2011-2013), руководимому нобелевским лауреатом Осамой Шимомурой, совместно с коллегами из московского Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН мы установили, что для производства света червям Henlea sp. требуются четыре основных компонента: люциферин, люцифераза, ионы кальция и кислород. Мы научились успешно проводить полный цикл исследований — от открытия и описания нового биолюминесцентного организма до определения химических структур компонентов биолюминесцентных систем и детализации механизма светоизлучения.

Валентин Петушков, кандидат биологических наук, и Наталья Родионова, кандидат биологических наук, научные сотрудники фотобиолаборатории Института биофизики ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН». Фото предоставлены пресс-службой Красноярского научного центра.

Сейчас группа занимается исследованием биолюминесценции недавно открытых в Сибири земляных червей рода Henlea. Они имеют некоторые физиологические и генетические различия, но одинаковую систему биолюминесценции, не похожую на открытые ранее.

— В чем же её отличия?

— Чтобы это понять, мы выделили компоненты биолюминесцентной реакции червей Henlea — фермент люциферазу и субстрат люциферин, о которых ничего не было известно, а также возможные другие участники реакции. Затем очистили эти компоненты, исследовали их свойства, определили структуры, получили их в лаборатории с помощью генетических методов и химического синтеза и воссоздали систему «в пробирке».

Наша статья в журнале Organic & Biomolecular Chemistry — следующий шаг к полному изучению уникальной биолюминесцентной системы Henlea sp. Были найдены нескольких активаторов биолюминесценции этих червей, усиливающие интенсивность свечения в десятки раз, а также удалось установить их химические структуры.

А теперь мы обнаружили ещё два вещества-активатора, многократно усиливающих биолюминесценцию. Одно из них оказалось аналогом витамина рибофлавина. Ранее его находили в археях и бактериях, где это соединение участвовало в защите ДНК микроорганизмов от ультрафиолетового излучения. Второй активатор представляет собой соединение, являющееся сульфатным производным первого активатора — дазафлавинсульфат.

— Теперь понятно, как это работает?

— Обнаруженные активаторы биолюминесценции червей Henlea sp. представляют собой необычные производные деазафлавина. Без них испускаемый световой сигнал очень слабый. Мы предполагаем, что активатор представляет собой флуоресцентный хромофор, который поглощает энергию после окисления люциферина и переизлучает её в видимом диапазоне света. Такого мы не встречали пока ни у одного биолюминесцентного организма. Полученные данные важны для понимания механизма работы биолюминесцентной системы.

Свечение фридериции Fridericia heliota в таёжной почве. Фото: Родионова Н., Петушков В.,ФИЦ КНЦ СО РАН.

— Правильно ли я поняла, что у разных видов червей биолюминесценция устроена по-разному?

— Да, каждая из этих червяковых биолюминесцентных систем уникальна. А ведь до наших исследований считалось, что биолюминесценция земляных червей проходит по единому перекись-зависимому механизму. Теперь таких механизмов известно, как минимум, три.

— И что нам теперь делать с этой информацией?

— Предполагается, что в мире существует 3–4 десятка биолюминесцентных механизмов. Когда наша команда начала совместную работу, в мировом списке было всего 7 люциферинов с известными структурами. Мы пополнили его тремя новыми структурами люциферина. Ещё две структуры в стадии исследования. Для фундаментальной науки это большой прогресс.

Получив данные о структурах этих веществ, мы разработали улучшенную стратегию синтеза, которая состояла всего из четырёх стадий, и получили синтетический деазафлавин, который усиливает свечение биолюминесцентной системы Henlea sp. на три порядка. Применяя его, теперь можно эффективно измерять биолюминесцентный сигнал при тестировании, что ускорит дальнейшее исследование. Заранее никогда не известно, как «выстрелит» результат и какое конкретное применение ему найдётся.

— Вы сказали, что ваш мегагрант возглавлял нобелевский лауреат Осама Шимомура. А ведь Нобелевскую премию он тоже получил за исследование свечения, но медузы…

— Да, это самый известный и подробно описанный случай биолюминесценции — зелёное свечение медузы Aequorea victoria, изучение которого и принесло Осаму Шимомуре Нобелевскую премию. Он выделил зелёный флуоресцентный белок — GFP и охарактеризовал его ещё в 1960-х годах, используя подходы того времени. Однако затем получили большое развитие методы генной инженерии и молекулярной биологии. Удалось секвенировать GFP, затем перевести его аминокислотную последовательность в последовательность ДНК, которая его кодирует, затем найти эту последовательность методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) в медузе.

Медуза Aequorea victoria, из которой был выделен белок GFP. Фото: Sierra Blakely/Wikimedia Commons.

Оказалось, что флуоресцентное свечение медузы совершенно уникально: оно кодируется всего одним геном. Такая простота позволила клонировать этот ген и искусственно наделять этим признаком клетки и живые организмы, встраивая ген в их ДНК. Это вызвало настоящий взрыв интереса к GFP как перспективной биохимической метке.

Так, примерно через 25 лет после открытия GFP оказалось, что это очень полезная вещь. Сейчас существуют сотни различных методик его применения. Все они сводятся к тому, чтобы с помощью флуоресценции наблюдать различные явления, которые происходят в клетках или целых организмах: экспрессию генов, развитие тканей, стволовых клеток, поведение раковых опухолей, взаимодействие белков друг с другом, судьбу клеточных органелл.

Например, помещённая в испытуемый организм раковая или стволовая клетка уже не сможет «замешаться в толпе» — она будет видна, где бы она ни оказалась. Более того, её «потомство», когда она начнёт размножаться, также будет носителем «гена светимости», и медики могут проследить всю возникающую «популяцию». Кстати, флуоресцирующие аквариумные рыбки — это тоже результат клонирования GFP, в природе их не существует. А Нобелевскую премию Шимомура и его коллеги получили лишь в 2008 году.

— Какие прикладные возможности использования биолюминесценции уже реальны?

— Любая система биолюминесценции сначала должна быть исследована, а применение ей находится позже согласно её индивидуальным свойствам и спектру соединений, которые либо сами участвуют в реакции люминесценции, либо через цепочки реакций соединены с участниками и влияют на параметры излучаемого света. Каждая новая система расширяет возможности применения биолюминесценции в разных сферах жизни людей.

Биолюминесцентные методы чрезвычайно чувствительны и, в отличие, например, от радиоактивных, безопасны. Их уже сегодня используют в медицине для проведения клинических анализов, в фармакологии — при поиске потенциальных лекарственных препаратов среди веществ-кандидатов, когда огромные роботы проводят много тысяч реакций одновременно.

Экологи применяют их для мониторинга загрязнений окружающей среды. Биолюминесцентные методы незаменимы для визуализации физиологических процессов, происходящих в клетках и целых организмах. В генно-инженерных исследованиях для того чтобы «увидеть» работу гена, можно «прицепить» к нему люциферазу и добавить к клеткам люциферин. В биохимических исследованиях биолюминесцентные системы задействуют для определения различных аналитов, в первую очередь — АТФ, ферментов, антител, антигенов. Результаты биолюминесцентных разработок можно применять даже в дизайне, например, на основе грибной биолюминесцентной системы уже созданы светящиеся растения, которые будут популярны в домах, садах и городских парках. Так что возможностей тут огромное количество, хотя на деле — это долгий и трудный путь, полный загадок и неожиданностей.